透明神经电极不仅用于检测神经信号和刺激神经组织，还能显著减少各种医学成像模式中的图像伪影。此外，当与光学系统集成时，它们能够在目标位置同时检测电信号和光信号。在本研究中，提出了一种低成本、高透明度和导电性的无机-有机神经电极阵列（BioCLEAR），该阵列由AgNW随机网络和GOPS掺杂的PEDOT:PSS组成。此外，还介绍了一种通过将BioCLEAR与植入式GRIN透镜集成，能够在特定脑区域进行体内电生理学和钙成像的系统。通过利用两种材料的优势，该电极展示了高导电性、优异的生物相容性以及在550 nm波长处超过85%的光学透光率。BioCLEAR的可行性通过各种体外和体内分析得到证明，包括电化学EIS、CV、加速浸泡测试、细胞活力评估、啮齿动物神经电生理学记录和钙成像。通过将BioCLEAR与GRIN棱镜透镜集成，成功进行了体内电生理学和钙成像，且图像伪影极少。BioCLEAR系统有望同时测量和分析来自神经系统的电信号和成像数据。
一、引言
神经电极是基本的生物电子器件，不仅广泛用于记录来自生物组织的电信号（如脑电波和肌电图），还提供电刺激。最近，神经电极已与尖端技术结合开发，一个代表性例子是与光学技术（如钙成像和光遗传学）的集成。这种集成使生物组织能够同时进行电学和光学交互。然而，神经电极与光学系统的集成存在一些挑战。第一个挑战涉及电极材料。传统神经电极材料，如包括铂（Pt）、钨（W）、铂铱（Pt-Ir）和氧化铱（IrOx）在内的金属是不透明的，这限制了它们的光学交互效率。此外，这些金属可能在磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）等医学成像技术中引入伪影。
为了克服金属导体的局限性，透明导体如石墨烯、碳纳米管（CNT）、氧化铟锡（ITO）、MXene、银纳米线（AgNW）和聚（3,4-乙撑二氧噻吩）：聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）已被积极应用于神经电极的开发。这些透明导体可以增强光学分析效率并减少医学成像中的伪影，实现精确的医学诊断。然而，这些材料在工艺复杂性、工艺规模、生物相容性等方面仍需要改进。例如，由于转移过程中使用的化学品，石墨烯的制造具有高复杂性，且工艺规模取决于石墨烯片尺寸。ITO的制造不仅由于真空沉积而涉及高复杂性和有限的工艺可扩展性，还需要高退火温度（高于200 °C），进一步限制了基底的选择。AgNW容易被氧化，导致低电化学稳定性，其水生毒性引发了对潜在生物毒性的担忧，应予以考虑。
另一个挑战是神经电极与光学技术的结合，这需要仔细考虑合适的集成设计。当光源或荧光镜等光学器件与神经电极分离时，可能需要扩大手术范围。因此，将神经电极和光学器件集成到单个系统中很重要，因为它减少了整体系统体积并最小化了组织损伤。然而，能够有效在目标深脑区域同时执行电学和光学观察的集成系统的开发仍然不足。
为了解决上述挑战，我们提出了一种将低成本、高性能无机-有机双层透明电极与渐变折射率（GRIN）透镜微型显微镜集成的新型系统。我们将该电极系统命名为双层无机-有机透明电极阵列（BioCLEAR），透明电极由可溶液加工的AgNW和PEDOT:PSS双层组成。两种材料均表现出高透明度和导电性，其可溶液加工的制造避免了真空设备和苛刻化学品，提供了低复杂性、高成本效益和可大规模生产的可扩展性。BioCLEAR电极表现出适合透明柔性神经电极的有利物理特性，包括超过85%的透光率和超过8000 S cm⁻¹的导电性。此外，化学成分分析和体外评估证实了其生物相容性，电化学评估展示了其作为神经电极的优异潜力和性能，表现出低阻抗和高电荷存储容量。
最后，为了证明BioCLEAR系统的体内应用，在啮齿动物中同时进行了电神经活动和GCaMP6钙成像。该系统能够在获得体内钙图像的同时进行大脑电生理学记录，且伪影最小。BioCLEAR系统为传统金属神经电极的局限性提供了一种有前景的解决方案。通过AgNW和PEDOT:PSS材料的结合，BioCLEAR系统在导电性和生物相容性之间实现了和谐平衡。BioCLEAR系统的体外和体内评估揭示了其革新低成本透明神经电极技术格局的潜力。
二、结果与讨论
2.1 BioCLEAR电极与特性
2.1.1 BioCLEAR电极制造工艺与集成系统概述
BioCLEAR系统的整体概念，包括电极结构和实验方法，如图1a所示。BioCLEAR是一种植入式神经记录器件，在柔性和生物相容性聚合物中结合AgNW和PEDOT:PSS层。AgNW和PEDOT:PSS的双层作为主要导电界面，直接与目标表面接口以进行生物信号检测。制造过程涉及基于溶液的方法和互补半导体技术，能够在单个晶圆上大规模生产BioCLEAR，如图1b所示。通过掩模驱动设计，可以在单个晶圆上同时制造多种神经电极配置。
图1. a) 双层无机-有机透明电极阵列（BioCLEAR）的示意图，以及使用BioCLEAR和光学系统进行神经记录和成像。b) 4英寸晶圆规模制造的BioCLEAR照片。c) BioCLEAR和金属电极的照片，显示透明度差异。d) PEDOT:PSS、AgNW、AgNW/PEDOT:PSS双层、BioCLEAR电极通道位点和非通道位点的透射光谱。e) 透明电极和BioCLEAR的可见光范围透光率与薄层电阻的比较。f) 包含安装在GRIN棱镜透镜（直径1 mm，长度9.1 mm）上的Inscopix基板和BioCLEAR的器件侧视图。BioCLEAR终止于带有16通道Omnetics连接器的PCB。g) BioCLEAR粘合到棱镜透镜面的特写图像。BioCLEAR中每列具有100、150和200 µm直径的电极。h) 带有Inscopix nVista微型显微镜和16通道Intan头级连接到器件上的小鼠，通过GRIN棱镜透镜进行钙成像和从BioCLEAR进行电生理学记录。
制造工艺按以下步骤进行。首先，在整个晶圆上均匀涂覆10 µm厚的聚对二甲苯C层。随后，使用光刻和剥离工艺在表面上图案化钛（Ti，50 nm）和金（Au，100 nm）。在沉积电极层之前，PEDOT:PSS用二甲基亚砜（DMSO）和3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）掺杂。DMSO增强了PEDOT:PSS的导电性，而GOPS改善了其水稳定性。然后，AgNW和PEDOT:PSS的双层依次旋涂到表面上。使用光刻胶（PR）刻蚀掩模，通过O₂和Ar等离子体（干法刻蚀）去除不必要的PEDOT:PSS和AgNW。刻蚀后，晶圆暴露于丙酮以去除PR，随后用异丙醇（IPA）洗涤以去除AgNW的所有氧化物残留。顶部钝化层为光敏环烯烃聚合物（COP）（Zeocoat CP1010），旋涂并使用光刻进行图案化，然后 subjected to UV light以增加透明度（即漂白）。COP钝化的优势在于其光可图案化性，能够通过光刻进行图案化而无需单独的刻蚀工艺。最后，为了刻蚀晶圆上的聚对二甲苯C涂层，使用光刻和剥离工艺形成铝（Al，100 nm）硬掩模。随后，使用O₂和SF₆等离子体反应离子刻蚀（RIE）进行刻蚀。将刻蚀后的晶圆浸入氢氧化钾（KOH）水溶液中以去除Al刻蚀掩模，随后用去离子水（DIW）冲洗。最后，将电极浸入DMSO进行后处理并在DIW中冲洗，然后将柔性电极从承载晶圆上释放。制造过程的示意图和详细信息见支持信息中的图S1，而DMSO后处理的效果和附加信息见支持信息中的图S2。
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图1c展示了BioCLEAR的光学透明度，得益于透明基底、电极和钝化膜。图1d显示了BioCLEAR电极在紫外（UV）至红外（IR）范围内的透射光谱。在550 nm波长处，PEDOT:PSS、AgNW和AgNW/PEDOT:PSS双层分别表现出94.25%、95.8%和91.26%的非常高的透光率值。此外，如支持信息中的图S3所示，基底和顶部钝化层聚对二甲苯C和COP分别显示94.58%和94.04%的透光率值。因此，由聚对二甲苯C/AgNW/PEDOT:PSS组成的电极通道区域在550 nm波长处的透光率为86.227%，而由聚对二甲苯C/COP组成的非通道区域为88.857%。因此，BioCLEAR电极在整个区域表现出超过85%的总体透光率。这一结果标志着BioCLEAR能够透射大部分可见光，使其适用于需要光学透明度的应用。图1e和表1总结了通过为BioCLEAR电极应用溶液工艺获得的过程优势，以及与先前报道的透明电极的薄层电阻（透明电极的关键参数）的比较。在本工作中，当基于透光率评估时，包括聚对二甲苯C基底在内，BioCLEAR电极对透明导体表现出非常高的品质因数（FOM，T/Rs）10.53。尽管具有这些优异的电极特性，BioCLEAR电极的制造不需要化学品或真空腔室，导致低工艺复杂性和成本。此外，由于它是通过溶液工艺制造的，不受导电片面积或腔室尺寸的限制，确保了极大的可扩展性并为未来发展提供了强大潜力。
表1. 透明电极和BioCLEAR的薄层电阻、可见光范围透光率、FOM、工艺复杂性、工艺成本和工艺规模的比较。
图1f–h描绘了通过将BioCLEAR与植入式渐变折射率（GRIN）棱镜透镜（直径1 mm，长度9.1 mm，Inscopix Inc.）集成进行的体内实验装置。图1f显示了器件的侧视图，该器件由安装在GRIN棱镜透镜和BioCLEAR上的定制Inscopix Inc.基板组成。BioCLEAR终止于带有16通道Omnetics连接器的PCB。图1g提供了BioCLEAR粘合到棱镜透镜面的特写图像。BioCLEAR中的每列具有100、150和200 µm直径的电极，能够基于电极尺寸观察结果的差异。最后，图1h描绘了配备Inscopix nVista微型显微镜和16通道Intan头级连接到器件上的小鼠，通过GRIN棱镜透镜进行钙成像和从BioCLEAR进行电生理学记录。
2.1.2 电学性质与表面分析
与AgNW或PEDOT:PSS单层相比，AgNW/PEDOT:PSS双层具有以下协同效应。首先，电阻降低，即电导率增加。在图2a中，PEDOT:PSS、AgNW和AgNW/PEDOT:PSS的电导率分别为1350.62、7598.78和8289.55 S cm⁻¹，这表明双层的电导率与PEDOT:PSS相比增加了514%，与AgNW相比增加了9.09%。AgNW/PEDOT:PSS双层电导率的增强归因于PEDOT:PSS降低了AgNW之间的结阻抗并补偿了随机网络中的电流通路损失（支持信息中的图S4）。此外，BioCLEAR作为柔性电极，即使在物理变形下也能保持优异的电导率和显著的稳定性。如图2b所示，当BioCLEAR电极弯曲至3 mm直径时，其电导率在最初100次弯曲循环后从8289.55降至8091.9 S cm⁻¹，随后在后续循环中仅略有降低。1000次弯曲循环后，电导率达到7996.56 S cm⁻¹，对应约3.53%的降低，展示了优异的机械稳定性。
图2. a) BioCLEAR中使用的电极材料的电导率比较（n = 5）。b) BioCLEAR根据弯曲循环次数的电导率变化。c) BioCLEAR的AgNW随机网络的TEM图像。d) BioCLEAR的SEM图像。e) 显示其形貌的BioCLEAR 3D AFM图像。f) 通过C-AFM的相对电导率分布和相应的形貌图像。g) BioCLEAR表面的XPS全谱和h) S2p峰分析。i) 显示PEDOT:PSS峰的BioCLEAR表面拉曼光谱数据。
第二个协同效应涉及表面体积比的增加。鉴于神经电极作为传感器在接触活体组织表面时检测信号，具有比平坦表面更大表面积的纹理结构具有诸如信噪比（SNR）改善等优势。图2c显示了构成BioCLEAR的AgNW随机网络的透射电子显微镜（TEM）图像。该结构表现出高度粗糙的表面，因为厚度取决于每个位置存在的AgNW数量。如图2d通过扫描电子显微镜（SEM）所示，BioCLEAR在粗糙的AgNW随机网络顶部具有PEDOT:PSS薄膜层，导致表面保持粗糙。为了在3D中评估BioCLEAR的粗糙表面，使用原子力显微镜（AFM）扫描表面，如图2e所示。结果显示在平均厚度150 nm处厚度变化高达±40 nm。150 nm厚BioCLEAR的平均表面粗糙度为15 nm，而100 nm厚PEDOT:PSS的平均表面粗糙度为3 nm（支持信息中的图S5）。图2f显示了使用导电原子力显微镜（C-AFM）评估的相对电导率分布，与插图中的Z高度对齐。在BioCLEAR的C-AFM图像中，相对电导率在插图中Z高度观察到的AgNW形貌处显得较高，而在AgNW外部区域相对较低。这表明BioCLEAR的电传导主要通过AgNW发生，PEDOT:PSS作为辅助通路。热传导中也观察到类似趋势，如支持信息中的图S5所示。
图2g呈现了用于识别BioCLEAR表面存在元素的X射线光电子能谱（XPS）全谱结果。排除XPS无法检测的氢，在BioCLEAR表面检测到氧、碳和硫，而未检测到银。这表明BioCLEAR内部的AgNW被PEDOT:PSS完全覆盖，未暴露在表面上。由于硫根据其化学形式可能有害，XPS全谱中的S2p峰被单独解卷积和分析。如图2h所示，BioCLEAR的S2p光谱被证实表现出PEDOT:PSS的典型形式。最后，图2i呈现了BioCLEAR的拉曼光谱图，表明双层表面不存在任何额外物质。这证实了BioCLEAR表面上仅存在PEDOT:PSS，进一步保证了其生物相容性。附加XPS和拉曼光谱结果见支持信息中的图S6和S7。
2.2 电化学性质
为了评估BioCLEAR作为神经电极的性能，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中进行了电化学阻抗谱（EIS）、循环伏安法（CV）和恒电流刺激。在图3a中，BioCLEAR在1 kHz频率下的平均阻抗测量为688.53 Ω，与面积为1.6 mm²的Au电极的阻抗434.69 Ω相当。对于神经电极，建议阻抗低于1 MΩ以确保记录生物信号时具有足够的信噪比（SNR），这种与金属相当的低阻抗表明其具有足够的体内植入性能。图3a的插图显示了由恒相位元件阻抗（CPE）、电荷转移电阻（Rct）、Warburg阻抗（W）和溶液电阻（Rs）组成的等效电路模型。图3b说明了BioCLEAR在1 kHz处的电化学相位为-6.2°，与金电极的相位-40.6°明显不同。这表明，在对应于神经尖峰的1 ms持续时间的电荷传输中，BioCLEAR表现出能够通过氧化还原反应转移大量电荷的法拉第电荷传输机制。这种电荷传输允许存储或注入比电容性电荷传输相对更高的电荷，使其不仅有利于神经记录，也有利于神经刺激。
图3. a) PBS中面积为1.6 mm²的BioCLEAR和金（Au）电极的电化学阻抗谱。b) BioCLEAR和Au电极的电化学相位谱。c) BioCLEAR与Au电极相比具有更高峰值电流的循环伏安法。d) BioCLEAR和Au电极在水窗口内电流刺激的电位响应。e) PBS和模拟大脑中BioCLEAR的电化学阻抗谱。f) PBS溶液中有无GOPS掺杂的BioCLEAR的阻抗趋势（n = 5）。
图3c中的CV测量结果表明，BioCLEAR与金电极相比表现出更高的峰值电流。高峰值电流和宽CV曲线面积突出了BioCLEAR改善的电荷存储容量（CSC）。从CV扫描中，从负电位窗口计算电荷（Q），然后按电极面积归一化以获得CSC。结果，BioCLEAR电极表现出47.6 mC cm⁻²，比Au电极（41.7 mC cm⁻²）高14.15%。这表明，在神经记录期间，BioCLEAR电极可以存储更多电荷，从而记录具有更大振幅的电位，并能够以更高信噪比（SNR）获取高质量信号。
为了评估神经刺激性能的关键参数电荷注入容量（CIC），分析了恒电流刺激下BioCLEAR和Au电极的电位响应，如图3d所示。由于超过水窗口的恒电流刺激诱导的电位差可能导致水电解和生物组织损伤，因此CIC在对应于神经尖峰的1 ms周期内以约1.5 V的近似极限进行分析，BioCLEAR和Au电极均产生相同的0.24 mC cm⁻²值。然而，BioCLEAR表面的赝电容响应降低了水电解的风险，与Au电极相比提供了更安全用于刺激的优势。同时，AgNW显示比其他电极显著更高的0.8 mC cm⁻² CIC的原因是，CIC与电极面积成反比，由于AgNW的随机网络未完全覆盖电极通道的整个开放区域，CIC显得更高。因此，虽然当前设计用于神经记录，但减小通道面积或增加脉冲宽度可以增强CIC并提高对神经刺激的适用性。
还应注意的是，导电聚合物（PEDOT:PSS）通常随着薄膜厚度的增加而表现出更高的CSC和CIC，因为较厚的薄膜提供更多的电活性体积并促进更大的离子存储和传输。然而，在本研究中，有意识地使用薄PEDOT:PSS层（约100 nm）以确保用于同步钙成像的光学透明度。不仅BioCLEAR和Au电极，而且AgNW和PEDOT:PSS透明电极在1 kHz处的阻抗、CSC和CIC的总结见表2，而AgNW和PEDOT:PSS的详细信息见支持信息中的图S8。
表2. Au、AgNW、PEDOT:PSS和BioCLEAR电极在1 kHz处的阻抗、CSC和CIC的比较。
为了验证BioCLEAR在体内检测脑电波的功能，评估其在类脑环境中的性能变得至关重要。因此，使用三硼酸-EDTA（TBE）缓冲琼脂糖凝胶构建模拟大脑，并在该模拟大脑内进行阻抗测量。如图3e所示，模拟大脑内的阻抗测量为7129.75 Ω，高于PBS中的阻抗（688.53 Ω），但显著低于1 MΩ，后者可能产生更高的噪声。在模拟大脑中展示适当的电化学性能突出了BioCLEAR用于体内神经电极应用的潜在适用性。考虑到PEDOT:PSS的高水溶性，用GOPS掺杂并在56.5 °C的PBS中进行加速浸泡测试。图3e描绘了GOPS掺杂和未掺杂BioCLEAR随时间的阻抗变化。在大约两个月内，由于有益的掺杂效应，GOPS掺杂BioCLEAR的性能稳定在约3.02 kΩ。另一方面，由于PBS中的水分和离子，未掺杂GOPS的BioCLEAR在15至20天之间经历了阻抗的快速增加。总之，添加少量GOPS交联了BioCLEAR电极通道表面上的PEDOT:PSS，增强了水稳定性并实现了长期性能。BioCLEAR表面的高稳定性防止PEDOT:PSS在水性环境中劣化，并且如支持信息中的图S9所示，抑制AgNW释放到水中，从而极大地促进了生物相容性。此外，如支持信息中的图S10所示，这种高稳定性提供了制造过程中抗应力的能力，确保即使对于各种通道尺寸也具有高阻抗再现性和电极通道产率。
2.3 细胞活力、体内成像和神经记录
2.3.1 细胞活力
为了确定BioCLEAR阵列是否具有生物相容性，我们在聚乙二醇（PEG）水凝胶上培养内皮祖细胞（EPC）、周细胞（PC）和神经祖细胞（NPC）（源自WTC11 iPSC）14天，水凝胶中嵌入或不嵌入BioCLEAR电极。选择这些细胞类型是因为它们代表大脑中通常发现的细胞类型。使用免疫荧光染色观察有BioCLEAR电极（图4a左）和无BioCLEAR电极（图4a右）孔中微管相关蛋白2（MAP2）阳性NPC（品红色）和细胞核（DAPI，蓝色）的存在，表明电极和钝化材料在体外环境中的毒性最小。值得注意的是，在含有BioCLEAR电极的孔中，细胞沿电极表面密集分布，并且在电极内也检测到荧光信号。有关各种神经元标志物和炎症相关标志物的信息见支持信息中的图S11。为了量化体外有或无电极存在时细胞的细胞活力，我们使用了活/死测定。与对照孔中76%的钙黄绿素阳性（活）细胞（n = 5）相比，含BioCLEAR电极的孔中约80%的细胞为钙黄绿素阳性（活）（n = 10），条件之间没有统计学显著差异（p > 0.05）。在图4b中，A和B电极孔代表含BioCLEAR的孔，"无电极"孔代表对照孔。因此，BioCLEAR在体外展示了优异的细胞活力，使我们能够自信地进行体内测试。细胞活力测试的详细信息见方法部分。
图4. a) 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像，显示在有BioCLEAR（左）和无BioCLEAR（右）的孔中生长2周的微管相关蛋白2（MAP2）阳性NPC（品红色）和细胞核（DAPI，蓝色）。b) 生长2周后的细胞活力结果，显示含BioCLEAR电极的孔（BioCLEAR A和B，n = 10）和无电极的孔（对照，n = 5）中活细胞相似。"ns"表示p值 > 0.05。c) 最大投影图像，展示4只不同小鼠在自由行为期间通过Inscopix nVista微型显微镜经由GRIN棱镜透镜获得的感觉皮层（S1）中GCaMP表达神经元的体内钙活动。所有3只带有BioCLEAR附着透镜的小鼠在整个视野中显示超过90个细胞。d) 器件植入8周后透镜-BioCLEAR放置和GCaMP表达的死后确认。来自3只不同小鼠的固定脑切片通过感觉皮层的图像和放大视图（插图），用DAPI染色以可视化细胞核（蓝色），展示神经元中稳健的GCaMP表达（绿色）。
2.3.2 体内钙成像
随后，如支持信息中的图S12所示，我们将BioCLEAR附着的GRIN棱镜透镜植入在锥体兴奋性神经元中表达GCaMP6的小鼠的感觉皮层中进行体内实验（器件/装置见图1f–h）。所有程序均按照美国国立卫生研究院通过的实验动物护理和使用指南进行，并经LifeSource Biomedical Services机构动物护理和使用委员会批准。对于所有手术，成年（20–25 g，8–10周）小鼠（n = 3）用1.5–2.0%异氟烷与1 L/min氧气混合麻醉，并放置在立体定向框架（Kopf Instruments，Tujunga，California）中。对于钙成像，将编码由CaMK2启动子驱动的钙指示剂GCaMP6m的腺相关病毒血清型1注射到感觉皮层。病毒注射后约2周，将BioCLEAR附着的GRIN棱镜透镜植入到大脑皮层表面下方约1 mm深度。详细的体内方法见方法部分。
图4c显示了在自由行为期间四只不同小鼠感觉皮层中GCaMP6表达神经元钙活动的代表性体内图像。在四只小鼠中，三只植入了带有BioCLEAR电极附着到棱镜面的GRIN棱镜透镜，一只仅植入了GRIN棱镜透镜（无BioCLEAR）。值得注意的是，如表3所示，所有四只小鼠无论是否存在BioCLEAR电极，均在整个视野中表现出超过90个细胞，信噪比（SNR）高于7.5。在活体小鼠中观察脑活动的时间为4–8周，不仅证明了与BioCLEAR相关的体内毒性问题不存在，而且由于其透明性质，其神经成像能力无图像伪影。支持视频S1和S2展示了植入后4周通过集成BioCLEAR电极的GRIN棱镜透镜获取的代表性动态荧光成像，清晰显示无伪影的钙活动。
表3. 从植入BioCLEAR附着GRIN棱镜透镜的小鼠和仅植入无BioCLEAR电极的库存GRIN棱镜透镜（直径1 mm，长度9.1 mm）的小鼠的钙电影中提取的成像指标比较。BioCLEAR透镜植入小鼠的成像指标与库存GRIN棱镜透镜的指标相当。
图4d描绘了BioCLEAR附着透镜放置和GCaMP表达的死后确认。显示的是来自三只不同小鼠的固定脑切片通过感觉皮层的图像。图像揭示了神经元内稳健的GCaMP表达（绿色），以及用DAPI染色的细胞核（蓝色）。带有BioCLEAR的三角形棱镜区域在图像中清晰可见。每个插图显示了与BioCLEAR电极接触界面处神经元区域的放大图像，通过高密度的细胞核和活跃的GCaMP表达展示了健康组织。BioCLEAR电极-透镜植入后8周的时间依赖性钙活动和植入后12周有/无BioCLEAR电极的透镜植入的比较死后确认见支持信息中的图S13。
2.3.3 体内神经记录
最后，为了证明BioCLEAR在体内神经记录中的能力，我们从植入BioCLEAR电极的活体啮齿动物大脑中收集了电生理学记录（器件/装置见图1f–h）。图5显示了使用BioCLEAR电极从感觉皮层（S1）获得的0.1至300 Hz范围内的局部场电位（LFP）、10至100 Hz范围内的beta/gamma活动以及300至6000 Hz范围内的多单元活动（MUA）。使用BioCLEAR电极（150 µm直径），图5a显示了氯胺酮给药前、氯胺酮治疗期间和给予氯胺酮逆转剂后记录的LFP和beta/gamma活动的变化。氯胺酮给药前未观察到显著模式，而在氯胺酮治疗期间，在所有3只小鼠的BioCLEAR电极上，2–3 Hz范围内出现了峰值振幅为200至1000 µV的清晰振荡LFP。给予氯胺酮逆转剂后，随着动物从麻醉中醒来，觉醒状态的beta/gamma活动变得清晰。这些与氯胺酮和氯胺酮逆转剂相关的特征在图5b所示的频谱中更清楚地说明，表明使用BioCLEAR电极的神经记录可以区分不同状态。根据BioCLEAR电极尺寸的平均LFP振幅如图5c所示。t检验发现不同电极尺寸之间LFP振幅没有差异。所有电极尺寸的代表性LFP、beta/gamma活动和频谱见支持信息中的图S14。
图5. 使用BioCLEAR从活体啮齿动物大脑记录的神经信号。a) 使用BioCLEAR电极（150 µm直径）在感觉皮层（S1）中氯胺酮给药前、氯胺酮治疗期间和给予氯胺酮逆转剂后的代表性体内局部场电位（LFP，0.1–300 Hz）和beta/gamma活动（10–100 Hz）神经记录。红色箭头指示氯胺酮诱导的2.5 Hz周期性振荡。b) 氯胺酮治疗期间（在2.5 Hz处显示峰值）和给予氯胺酮逆转剂后（在2.5 Hz处无峰值）上述结果的LFP频谱。c) 根据BioCLEAR电极尺寸的平均LFP振幅（n = 3只小鼠；每只小鼠电极通道，n = 6；总计，n = 18）。"ns"表示p值 > 0.05。d) 使用BioCLEAR电极（150 µm直径）在感觉皮层（S1）中氯胺酮治疗期间振荡局部场电位（LFP，0.1–300 Hz）和振荡多单元活动（MUA，300–6000 Hz）的代表性体内神经记录。e) 根据BioCLEAR电极尺寸的平均MUA振幅、MUA噪声和f) 信噪比（SNR）（n = 1只小鼠；每种尺寸电极通道，n = 3；总计，n = 9）。*和**分别表示p < 0.05和p < 0.01。g) 根据BioCLEAR电极尺寸的MUA阈值交叉尖峰。
同时，使用BioCLEAR电极（150 µm直径）记录的MUA也表现出氯胺酮诱导的清晰振荡活动，如图5d所示。如图5e所示，100、150和200 µm电极尺寸的平均振荡MUA振幅分别为19.6、27.7和21.8 µV，而平均MUA噪声水平分别为16.4、13.2和11.2 µV。每种电极尺寸的代表性记录结果见支持信息中的图S15。如图5f所示，100、150和200 µm尺寸的平均MUA SNR分别为1.2、2.1和1.9。与LFP结果不同，t检验揭示了取决于电极尺寸的MUA显著差异，特别是，MUA噪声随电极尺寸增加而降低，表明通过优化电极尺寸可以增强SNR。植入后MUA噪声的时间依赖性变化和根据电极尺寸的MUA噪声差异见支持信息中的图S16。图5g显示了从所有电极尺寸记录的MUA的代表性阈值交叉（交叉阈值 = 均值 ± 4标准差），显示了负向和正向MUA尖峰。所有3种电极尺寸记录的MUA尖峰似乎在整个电极表面积上平均良好，而不是明显的单个单元。与200 µm电极（21 µV）相比，150 µm和100 µm电极通常记录更高振幅（27–28 µV）的MUA尖峰。
本研究中用电极记录的MUA振幅（21–28 µV）和SNR值（1.2–2.1）似乎与参考文献中类似尺寸电极显示的值相当。本研究中的电极尺寸似乎更适合LFP记录，而非MUA活动。要将MUA SNR提高到足以进行单单元尖峰分类的水平，根据先前研究，电极尺寸必须减小到<70 µm。然而，值得注意的是，本研究中电极的MUA噪声水平有些大，与Michigan探针中20 µm铱电极相当。
2.3.4 体内神经记录与钙成像同时进行
最后，通过从成像数据采集系统（DAQ）以10 Hz采样发送同步脉冲到以30 kHz采样的电生理学DAQ，以纠正时间差异，评估和验证了BioCLEAR电极与Inscopix微型显微镜系统在GCaMP小鼠中同时进行神经记录和钙成像的集成。如图6a所示，来自BioCLEAR电极的LFP记录表现出氯胺酮诱导的清晰振荡活动，并且从三个细胞（82、108、212）记录的钙迹线中也观察到类似的振荡模式。在定性比较15秒内的振荡活动时，它们没有完全匹配，但观察到部分相似的模式。图6b呈现了LFP记录和三个细胞钙迹线的频谱。LFP记录在2 Hz处表现出清晰的峰值，反映了振荡活动。相比之下，所有三个细胞的钙迹线在1.6 Hz处显示出明显的峰值，而没有LFP记录中看到的2 Hz峰值。为了检查LFP记录和钙迹线之间的相关性，将30 kHz LFP数据下采样至10 Hz并与10 Hz钙迹线进行比较。下采样的LFP记录也在2 Hz处显示出清晰的峰值。
图6. 植入后第4周在氯胺酮下进行同步神经记录（30 kHz）和钙成像（10 Hz）。a) 来自BioCLEAR电极的LFP记录与3个不同细胞的钙迹线重叠。b) LFP记录和下采样LFP信号（10 Hz）的频谱以及所有3个细胞钙迹线的频谱。c) 三个细胞钙迹线之间的相关性及Pearson相关系数，以及下采样LFP信号与三个细胞钙迹线之间的相关性及Pearson相关系数。
图6c评估了三个细胞钙迹线之间的相关性以及LFP记录与每个钙迹线之间的相关性。虽然细胞钙活动显示出中等正相关（相关系数0.67），但在下采样LFP迹线与任何钙迹线之间未检测到有意义的相关性。尽管LFP记录和钙迹线在不同频率（2 Hz vs 1.6 Hz）表现出振荡活动，但它们可能仍在编码相关信息。总之，本研究确立了同时进行电生理学记录和钙成像的可行性。未来的工作将把这些测量扩展到其他实验范式。
三、结论
将透明柔性BioCLEAR电极与Inscopix微型显微镜相结合的集成系统，通过全面的实验结果展示了获取神经元信号的电学和光学方面的足够性能。基于AgNW和PEDOT:PSS的BioCLEAR电极在550 nm处表现出超过85%的透光率，其品质因数（FOM，T/Rs）超过10，表明作为透明电极的优异性能。此外，即使在约1000次弯曲循环后，它仍保持了约8000 S cm⁻¹的高电导率，展示了出色的性能。
BioCLEAR电极由AgNW/PEDOT:PSS双层组成，粗糙度为15 nm（其平均厚度150 nm的10%），这增加了表面体积比，从而增强了与生物组织的接触面积。支持活性氧化还原反应的PEDOT:PSS和提供高电导率的AgNW的组合产生了优异的电化学性能，电荷存储容量为47.6 mC cm⁻²——甚至优于金。重要的是，由于电极表面由PEDOT:PSS而非缺乏电化学稳定性的AgNW形成，BioCLEAR电极不仅具有生物相容性，而且能够通过GOPS掺杂保持长达60天的稳定电化学性能。
在传统系统中，由于电极不透明，神经电极与光学器件的集成在光学效率方面受到严重限制，其设计使深脑应用特别困难。然而，通过将BioCLEAR电极与微型显微镜系统集成，我们即使在深脑区域也实现了同步体内神经记录和无伪影钙成像。通过将钙成像与细胞外电生理学记录相结合，可以利用它们的互补优势，同时监测不同空间和时间尺度上的脑活动，从而为脑功能和功能障碍提供前所未有的见解。BioCLEAR微型显微镜系统可以解锁几种新颖应用，例如：1）研究与临床相关的电生理学生物标志物（LFP）和细胞类型特异性神经元集群回路动力学之间的关系，2）局部网络状态（LFP）触发的闭环光遗传学，3）研究与临床相关的电微刺激的潜在机制和参数优化。此外，连接到插入大脑的GRIN透镜的BioCLEAR微型显微镜系统，取决于透镜的尺寸和设计，能够在深脑区域进行神经记录和体内钙成像。
我们还注意到，尽管上述提出的BioCLEAR具有上述优势，但可以根据应用适当使用各种透明电极材料。对于数年的长期神经植入，最好将网状形式的高度稳定金属电极制成。随着生产价格逐渐下降和能够大面积加工的设备技术发展，石墨烯等新材料也可能商业化。尽管如此，目前可以通过低成本、大规模生产预期高度透明和导电的BioCLEAR商业化。当与光学系统结合时，它将作为透明神经植入物具有巨大潜力。
四、实验部分
4.1 BioCLEAR制造细节
制造的第一步，使用聚对二甲苯涂层机（OBANG Technology）通过化学气相沉积方法涂覆聚对二甲苯C。光刻整体程序中使用的PR为AZ5214E。基本上，它用作正性光刻胶，但也可以通过使用曝光和泛光曝光的方法用作负性光刻胶。AgNW IPA分散液为1 wt.%（DUKSAN hi-metal），但添加了IPA将浓度降低至0.5 wt.%，因为刻蚀后可能留下太多副产物。PEDOT:PSS（Clevious PH1000）、DMSO和GOPS以200:10:1的体积比混合。DMSO旨在增加电导率，GOPS掺杂以增加水稳定性。构成电极层的两种薄膜依次以2000 rpm涂覆30 s并在110 °C退火，低于聚对二甲苯C的玻璃化转变温度120 °C。形成电极的双层刻蚀总共包括两个步骤。首先，使用氧等离子体去除PEDOT:PSS薄膜，然后使用氧等离子体氧化AgNW以膨胀体积并产生裂纹，以及使用氩等离子体使大于裂纹的部分坍塌。Zeocoat CP1010是一种光敏环烯烃聚合物（COP），像正性PR一样使用光刻进行图案化。COP图案化后，图案化的封装层呈黄色，因此使用UV光对封装层进行漂白。由于漂白的封装层对化学品很弱，因此在真空烘箱中烘烤封装层以使其稳定。对于聚对二甲苯C的刻蚀，使用Al作为刻蚀掩模，因为Al可以承受O₂和SF₆等离子体的长时间暴露。在此过程中，聚对二甲苯C刻蚀中同时使用SF₆和O₂的原因是为了排除聚对二甲苯C刻蚀后产生的残留层纳米森林。剩余的Al薄膜用KOH水溶液快速去除，晶圆用去离子水洗涤。由于BioCLEAR的PEDOT:PSS表面的电学性质取决于pH，对在Al薄膜去除过程中暴露于碱的晶圆进行后处理，将其浸入DMSO约10 min，然后在DIW中冲洗。最后，在晶圆上滴加DIW后，用镊子轻轻提起电极边缘，由于硅晶圆和聚对二甲苯C基底之间的润湿性差异而释放电极。
4.2 BioCLEAR表征
使用源表单元（SMU）的四探针测量系统测量PEDOT:PSS和双层的薄层电阻。在SEM测量之前，使用碳胶带将BioCLEAR平贴在载玻片上，并涂覆薄Pt膜以防止有机材料SEM测量期间产生的损伤。SThM和C-AFM使用AFM（NX10，Park system）的附加功能进行测量，双层薄膜涂覆在20 mm方形玻璃上，使用银浆与额外偏压接触。XPS测量样品在20 mm方形玻璃上形成，类似AFM，对于拉曼测量，在硅基底上形成以进行激光反射和波长校准。使用恒电位仪（PGSTAT302N，AUTOLAB）与pH 7.2的PBS（WELLGEN）测量BioCLEAR的电化学性质。BioCLEAR由16个通道和焊盘组成；焊盘连接到定制印刷电路板（PCB），通道浸入PBS中。与BioCLEAR连接的PCB使用ZIF夹（TDT system）连接到恒电位仪，并对16个通道重复进行相同测量。EIS测量从1 × 10^(5)至0.1 Hz进行，CV测量以0.2 V/s的扫描速率进行三次扫描以获得最后第三次扫描的数据。BioCLEAR使用PDMS附着到直径1 mm的光纤上，并与光纤一起插入模拟大脑中。对于加速浸泡测试，包含在圆柱体中的PBS在56.5 °C的循环水浴中双重煮沸，圆柱体通过将BioCLEAR通道浸入PBS中密封。BioCLEAR从圆柱体中取出，在每个小时结束时在室温PBS中测量，以在相同条件下进行测量，并双重煮沸新的PBS圆柱体，因为PBS的浓度已发生变化。
4.3 电极细胞培养
可降解聚乙二醇（PEG）水凝胶（PEG 40 mg mL⁻¹，Tryp-MMP 60%，CRGDS 2 mm，I2959 0.05%）在血管生成载玻片（Ibidi #81 506）的15个孔中聚合，其中10个孔含有电极，5个孔不含。电极夹在两层PEG水凝胶之间（下方6 µL，上方4 µL，无电极孔10 µL），凝胶在37 °C的DME/F12（Gibco #11-330-057）中溶胀过夜，然后添加细胞。将WTC11来源的内皮祖细胞（2 × 10^(4)）和WTC11来源的周细胞（4 × 10^(3)）以每孔最终体积50 µL添加到E7V培养基中的每个孔中。每天用新鲜培养基重新喂养细胞。第7天，将WTC11来源的神经祖细胞（2.5 × 10^(4)）以每孔50 µL N2B27培养基添加到每个孔中，每天重新喂养细胞。7天后，进行活/死细胞活力测定。E7V培养基由DF3S（Gibco #A14535DJ）、20 µg mL⁻¹胰岛素（Sigma #I9278）、50 ng mL⁻¹ VEGFA165（R&D systems #293-VE-500/CF）、100 ng mL⁻¹ FGF2（R&D systems #233-FB-500/CF）、10.7 µg mL⁻¹转铁蛋白（R&D systems #2914-HT）组成。N2B27培养基由DF3S、N2补充剂（Thermofisher #17 502 048）和B27补充剂（Thermofisher #17 504 044）组成。
4.4 细胞活力测定
活细胞通过细胞内酯酶活性的存在来区分，该活性由细胞渗透性钙黄绿素AM转化为荧光钙黄绿素确定，钙黄绿素保留在细胞内。乙锭进入细胞膜受损的细胞，当与核酸结合时产生明亮的红色荧光。因此活细胞为绿色，死细胞为红色。第14天，用每孔50 µL含1 µm钙黄绿素-AM（Thermofisher #C1430）和1.5 µm乙锭同型二聚体-1（Thermofisher #E1169）的N2B27重新喂养细胞，在37 °C孵育20 min，然后在倒置Nikon-Ti Eclipse荧光显微镜上以10倍放大率成像。对每个孔周围的多个区域进行成像以减少采样偏差，每个孔至少5张图像。使用ImageJ分析图像，阈值化后，使用分析颗粒功能计数红色和绿色细胞。
4.5 免疫荧光染色
用4%多聚甲醛（Fisher #18 612 139）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher #1 419 144）中固定细胞，并使用MAP2抗体（Novus #NB300213）以1:1000稀释进行免疫荧光染色以可视化神经祖细胞。简要地说，将含有1× PBS、10%山羊血清（GS）（Fisher #16-210-064）、1%牛血清白蛋白（BSA）（Fisher #BP1600）和0.25% Triton X-100（Sigma #T9284）的封闭缓冲液添加到孔中，在室温下孵育4 h。去除封闭缓冲液，替换为每孔40 µL抗体缓冲液，含有1× PBS、1% GS、1% BSA和0.25% Triton X-100，以及1:1000稀释的MAP2抗体，在4 °C下过夜孵育。用PBS洗涤孔6次，每次30 min，并在抗体缓冲液中添加1:200稀释的山羊抗鸡647（life technologies #A21449），在室温下孵育4 h。用PBS洗涤孔6次，每次30 min，并在Zeiss LSM880共聚焦显微镜上使用Airyscan以10倍放大率成像。
4.6 动物受试者
所有程序均按照美国国立卫生研究院通过的实验动物护理和使用指南进行，并经LifeSource Biomedical Services机构动物护理和使用委员会批准。成年（20–25 g，8–10周）C57BL/6J小鼠在手术前群养，随意获取食物和水。小鼠维持在反向12小时光周期（上午8:00关灯）。
4.7 病毒构建
编码由CaMK2启动子驱动的钙指示剂GCaMP6m的纯化和浓缩腺相关病毒血清型1（AAV1-CaMKII-GCaMP6m）由Vigene Biosciences包装，滴度为1.59 × 10^(13)基因组拷贝（GCs）/mL。
4.8 病毒注射手术
对于所有手术，小鼠（n = 3）用1.5–2.0%异氟烷与1 L/min氧气混合麻醉，并放置在立体定向框架（Kopf Instruments，Tujunga，California）中。使用加热垫（40-90-2-07，FHC，Bowdoin，Maine）将体温维持在37 °C。小鼠接受皮下注射酮洛芬（2.5 mg kg⁻¹）和卡洛芬（2.5 mg kg⁻¹）。做垂直切口暴露颅骨，清除任何残留组织以便前囟和lambda清晰可见。在注射部位上方（小鼠S1：-1.0 AP，1.5 ML）制作一个小钻孔。使用配备33G针头的注射器，将1 µL病毒吸入注射器。然后将注射器连接到立体定向臂，由UMP3超微泵（WPI，Sarasota，FL）固定，针头尖端在大脑表面上方归零。然后将针头通过钻孔降低到大脑表面下方0.2、0.4、0.6 mm的注射深度，以100 nL min⁻¹的速率在每个深度注射200 nL病毒。在将针头以50–100 µm s⁻¹的速率移出大脑之前，分配5 min的输注后时间。缝合颅骨上的切口，将动物返回到其笼中，放在加热垫上恢复和清醒，然后放回饲养室，72小时内随意获取80 mg/200 mL对乙酰氨基酚水。器件植入发生在2周后，遵循以下描述的方案。
4.9 器件植入手术
对于所有手术，小鼠（n = 3）用1.5–2.0%异氟烷与1 L/min氧气混合麻醉，并放置在立体定向框架（Kopf Instruments，Tujunga，California）中。使用加热垫（40-90-2-07，FHC，Bowdoin，Maine）将体温维持在37 °C。小鼠接受皮下注射酮洛芬（2.5 mg kg⁻¹）和卡洛芬（2.5 mg kg⁻¹）。在对侧半球远离透镜阵列坐标处放置单个颅骨螺钉（19010-10，Fine Science Tools，Foster City，California）。在目标脑区域上方（小鼠S1：-1.0 AP，1.65 ML）进行颅骨切开术，小心去除硬脑膜。器件在插入前放置在连接到立体定向臂（Kopf Instruments，Tujunga，California）的螺纹假显微镜（Inscopix PN：1050–003762）上。在皮层中做1 mm长度、平行于中线和1 mm深度的切口，以允许棱镜插入皮层。用无菌盐水浸泡的明胶海绵控制出血。切口后立即，以约10 µm/s的速率将透镜阵列植入到大脑表面下方1 mm深度。在颅骨切开术和透镜阵列基座周围应用Kwik-sil（World Precision Instruments，Sarasota，Florida）以覆盖任何暴露的脑组织，延伸至颅骨表面以上的剩余部分用metabond（Parkell，Edgewood，New York）固定并由颅骨螺钉锚定。参考和接地线（120 µm PFA涂层铂线；部件号773 000，A-M systems）固定到颅骨螺钉上。参考螺钉放置在植入对侧的-6.0 AP，-1.0 ML处。接地螺钉放置在植入同侧的-6.0 AP，1.0 ML处。
4.10 体内成像会话和分析
所有成像会话在（24英寸 × 24英寸）开放场室中进行。简要地说，动物被抓住，Inscopix nVista微型显微镜对接在其基板上，放入室中在开放场探索期间进行成像。每次成像会话微调微型显微镜焦点以获得适当的视野。成像会话在植入后2、3和4周以每秒10帧进行，持续19–20分钟（Inscopix数据采集软件，Inscopix，Inc.）。为每次记录会话调整LED功率（范围：0.2–1 mW）和增益（范围：2–8）传感器设置，以近似标准化所有小鼠内和跨小鼠所有记录会话的基线荧光计数范围。所有记录的电影经过空间下采样（2×），刚性平移运动校正，并根据基线荧光（Δf/f）归一化，最后，使用PCA/ICA提取单个细胞及其相应的钙迹线（Inscopix数据探索、分析和共享（IDEAS）平台，Inscopix，Inc.）。
4.11 体内神经记录和分析
简要地说，动物被抓住，16通道数字头级（部件号C3334，Intan Technologies）连接到动物上的16通道Omnetics连接器。每只小鼠在记录前接受75 mg kg⁻¹氯胺酮和0.5 mg kg⁻¹美托咪啶在同一注射器中的混合物，腹腔注射（IP），按体重给药，然后放置在诱导室中，在整个记录期间给予富氧空气。氯胺酮麻醉的持续时间为30至90分钟。在氯胺酮下记录后，小鼠给予2 mg kg⁻¹阿替美唑（氯胺酮逆转剂），也是IP。使用头级（部件号C3334，Intan Technologies）和数据采集板（部件号OEPS-9030，Open Ephys）以及开源软件（Open Ephys）以30 kHz采样率获取宽带记录（0.1–6000 Hz）。使用定制MATLAB脚本分析记录数据，从宽带记录中提取局部场电位（0.1–300 Hz）、Beta/Gamma活动（10–100 Hz）和多单元活动（300–6000 Hz）。振荡局部场电位（0.1–300 Hz）的峰峰值振幅计算为15个不同ON状态的平均值。振荡多单元活动SNR计算为信号平均峰峰值振幅（15个不同ON状态的平均值）与噪声平均峰峰值振幅的比率。MUA噪声的平均峰峰值振幅计算为记录持续时间内的均值 ± 2.5标准差。
4.12 同步神经记录和钙成像
在氯胺酮麻醉下的小鼠中同时进行LFP记录和钙成像。LFP记录由电生理学（Ephys）数据采集单元（DAQ）以30 kHz采样，成像以10 Hz进行。对于同步神经记录和钙成像，来自成像DAQ的SYNC脉冲作为输入发送到Ephys DAQ，以纠正两次记录的开始时间差异。
4.13 死后组织学
研究8周后，所有小鼠安乐死并经心脏灌注PBS，随后灌注4%多聚甲醛（PFA），提取的大脑在4% PFA中后固定约12 h。大脑在振动切片机上以50 µm厚的冠状切片切割。切片在PBS中洗涤，然后准备在载玻片上进行组织学评估，随后用IBA-1（兔抗IBA1，Wako Pure Chemical，1:1000）染色以评估植入部位的炎症存在，并用DAPI（DAPI Fluoromount-G PN：0100–20，Southern Biotech）复染以可视化单个细胞核。图像在Leica DMi8倒置落射荧光显微镜上获取。
