在神经科学研究和临床实践中，电生理学被用于以高时间分辨率记录和刺激大脑的特定部位。这一能力可以通过磁共振成像（MRI）得到增强，后者以大的空间覆盖范围提供关于大脑的解剖和功能信息。然而，电生理学中常用的金属电极由于加热问题和成像伪影，与MRI根本不相容。在此，研究人员证明了柔性微皮层脑电图（µECoG）阵列——其电极由聚（3,4-乙撑二氧噻吩）掺杂聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）制成——与高达9.4 T的超高磁场MRI兼容。采用了一种可扩展的制造工艺，该工艺在器件间产生了非常可重复的电化学性质。PEDOT:PSS的体积电容导致低电极阻抗，并实现了来自啮齿动物皮层表面的单单元活动的高分辨率神经记录。此外，µECoG阵列在T2加权解剖脑MRI中创造了最小的畸变。通过同步执行血氧水平依赖功能磁共振成像（BOLD fMRI）与来自µECoG阵列的电刺激，展示了多模态脑监测。结果表明，PEDOT:PSS µECoG阵列实现了体内高分辨率电生理学与先进脑成像的结合。
一、引言
细胞外电生理学借助微电极阵列（MEA）在神经科学中发挥着关键作用。与细胞内电极相比，这些阵列能够以高时间分辨率探测和刺激大型神经元集群。微电极的密集布局还能在单个神经元的尺度上表征神经回路。尽管多年来取得了显著进展，微电极一直局限于使用贵金属及其化合物，如金（Au）、铂（Pt）、铂铱合金、氮化钛，以及最近出现的氧化铱。历史上，材料的选择受到生物相容性和体内稳定性的严格条件以及其与成熟微加工技术兼容性的指导。导电聚合物电极因其优于传统金属电极的信噪比（SNR）和电荷注入能力而成为一种替代方案。聚（3,4-乙撑二氧噻吩）掺杂聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）是研究最广泛的导电聚合物之一，已被用于体内电生理学的皮层内和表面探针。PEDOT:PSS是一种混合电子-离子导体，具有大体积电容，可降低电极阻抗并减少热噪声。因此，PEDOT:PSS电极能够从大脑表面记录细胞外动作电位，超越了传统皮层脑电图（ECoG）的可能性。它们还通过降低神经刺激期间的电压过冲来提高安全性。
然而，单独的电生理学只能提供关于大脑功能的有限信息。尽管具有高时间分辨率，但它缺乏选择性，且覆盖范围相对较小。相反，磁共振成像（MRI）等脑成像技术具有非侵入性研究全脑解剖结构的多功能性。此外，血氧水平依赖功能磁共振成像（BOLD fMRI）可以通过将其与大脑中氧合血液的分布相关联，从深层神经组织"成像"神经活动，尽管空间分辨率较低。越来越清楚的是，将MRI图像与电生理学相关联可以更深入地理解大脑功能。这从脑电图（EEG）引导的fMRI在神经系统疾病临床诊断中的广泛使用，以及尽管尚处于初级阶段，但用于绘制大脑活动的动物模型同步神经记录和fMRI研究中得到了证明。除了记录外，传递电刺激可能比躯体感觉刺激更有效，因为动物通常在MRI扫描期间处于麻醉状态。将刺激与同步fMRI配对还将有助于理解电刺激的局部和全局效应。
尽管它们具有互补能力，但由于金属的高频感应加热、信号损失和邻近组织的成像伪影，传统金属电极难以实现同步MRI和电生理学。MRI兼容电极最近受到了相当大的关注。薄膜金属电极与常规较厚金属相比，温度变化更小。具有分形网格设计的金属电极也被提出用于减少加热。此外，常用的金属电极与周围组织的磁化率显著不同。这种不匹配导致B0场的局部畸变，改变激发频率并引起空间编码误差，或在极端情况下导致信号丢失。由石墨烯涂层铜（Cu）线、碳纳米管（CNT）和石墨烯纤维制成的穿透电极因其磁化率与水的磁化率（Cu：-9.63 ppm，CNT纤维：-26 ppm vs Pt：279 ppm vs 水：-9.05 ppm）相当而被发现适用于MRI，水是组织中最丰富的成分。基于类似概念，玻璃碳、碳丝电极和聚合物封装铟纤维也被用于MRI。最近，基于薄膜金属的临床ECoG阵列被证明与MRI兼容，与临床标准的2 °C相比，温度仅增加0.44 °C。该阵列产生的成像伪影明显少于临床ECoG网格。
从根本上说，金属电极对兆赫兹范围（MHz）的射频（RF）是不透明的，而MRI中使用的正是该频率（即B1场），这会导致信号损失。PEDOT:PSS的等离子体频率低于金属导体，已被证明是MRI中MHz透明度的理想候选材料。基于PEDOT:PSS的水凝胶硬膜下电极已被证明可在离体条件下允许MRI成像。然而，尚未使用这些电极展示同步电生理学和MRI测量。此外，这些电极还因其相对较大的尺寸而限制了神经记录的分辨率。大尺寸还意味着它们与小型动物模型不兼容。
在此，我们开发了支持同步电生理学和MRI的PEDOT:PSS微皮层脑电图（µECoG）阵列。此前，我们已在玻璃上开发了光学透明的PEDOT:PSS MEA。我们利用相同的可扩展光刻图案化技术，通过反应离子刻蚀（RIE）来开发柔性和可贴合的µECoG阵列。由于其低阻抗，当植入啮齿动物模型时，这些阵列产生了高质量的神经记录，能够解读来自大脑表面的细胞外动作电位。此外，µECoG阵列在超高磁场MRI（9.4 T）中得到了验证，其中超薄阵列的小尺寸创造了最小的成像伪影。此外，在同步电生理学和成像的范式中，通过µECoG阵列传递电刺激，并通过BOLD fMRI对神经活动的变化进行成像。本文介绍的PEDOT:PSS µECoG阵列为与大脑接口提供了一种新方法，实现了高时空分辨率和大规模MRI的结合电监测和调节，并为大脑功能提供了新的见解。
二、结果
2.1 开发用于同步电生理学和MRI的柔性PEDOT:PSS µECoG阵列
我们采用先前报道的工艺，从超薄聚对二甲苯C薄膜制造了柔性µECoG阵列。如图1a的示意图所示，这些阵列由3层组成：2 µm厚的聚对二甲苯C基底、位于机械中性平面的图案化PEDOT:PSS电极和Au互连线，以及另一层2 µm厚的聚对二甲苯C绝缘层。图1b显示了阵列记录区域的光学图像和单个电极的放大视图。我们将µECoG阵列设想为一个大面积网格，其中32个记录位点稀疏分布在约2 × 2 mm²区域内，以与皮层的多个区域接口。记录区域设计有通孔，以确保贴合接触并通过允许脑脊液循环来避免皮层窒息。详细的制造过程在方法部分描述，并在图S1（支持信息）中进行了说明。在此，我们想强调PEDOT:PSS层的图案化，这是制造阵列中最关键的步骤。我们此前报道了通过光刻和RIE对PEDOT:PSS进行可扩展图案化。然而，将该工艺从刚性玻璃转换为柔性聚对二甲苯C基底需要重大修改。RIE期间过度暴露于等离子体会导致聚对二甲苯C薄膜脆弱且粘附性强，无法从承载硅（Si）晶圆上释放。图S2（支持信息）显示了所得脆性聚对二甲苯C层的图像。图1c显示了我们在本工作中遵循的PEDOT:PSS图案化修改策略。从图案化的Au连接线开始（I），旋涂约400 nm的PEDOT:PSS薄膜并在去离子（DI）水中浸泡过夜（II）。接下来通过光刻定义光刻胶刻蚀掩模（III），并通过四氟甲烷（CF4）和氧气（O2）的RIE对PEDOT:PSS进行图案化（IV）。我们设计了刻蚀掩模，使得PEDOT:PSS仅在µECoG轮廓周围被刻蚀，而在晶圆的其他区域保持完整。这最大限度地减少了聚对二甲苯C对等离子体的不必要暴露，并实现了阵列从Si晶圆的成功和可靠释放。
图1. 通过光刻和RIE对PEDOT:PSS µECoG阵列进行可扩展制造，产生了可重复的低阻抗电极。a）柔性阵列的示意图，显示逐层组成：底部为聚对二甲苯C基底、Au走线、PEDOT:PSS电极和走线，以及聚对二甲苯C绝缘层。b）阵列记录位点的光学图像（左）和同一区域的放大视图，显示几个电极和为贴合接触设计的空腔（右）。比例尺：左，500 µm；右，100 µm。c）PEDOT:PSS图案化的示意图说明。从图案化Au的聚对二甲苯C（i）层开始，旋涂PEDOT:PSS并在DI水中浸泡（ii）。光刻胶刻蚀掩模被图案化，使得PEDOT:PSS仅在单个阵列周围被刻蚀，并在承载晶圆的其余部分保持（iii）。随后进行PEDOT:PSS的RIE（iv）。d）PEDOT:PSS电极EIS测量的代表性幅值和相位图。e）不同批次制造的阵列电极在1 kHz阻抗的分布。此处考虑了来自3个批次的12个器件（共384个电极）中的343个有源电极（即阻抗 < 1 MΩ）。黑色线所示的高斯拟合（R² = 0.96）表明平均阻抗为38.9 ± 7.7 kΩ（均值 ± σ）。
随后，我们通过电化学阻抗谱对PEDOT:PSS电极进行了表征。图1d中的阻抗幅值和相位图表明在较低频率下具有电容行为，但相位尚未达到-90°，正如理想电容器所预期的那样。假设PEDOT:PSS电极为不完美电容器，使用具有恒相位元件（CPE）的Randles等效电路模型来拟合电化学阻抗谱（图S3a，支持信息）。图S3b（支持信息）表明估计电路参数的奈奎斯特图与测量结果密切匹配。可重复和可扩展的PEDOT:PSS图案化方法导致不同批次之间1 kHz电极阻抗的窄分布，平均约39 kΩ（图1e）。这低于我们此前报道的透明PEDOT:PSS MEA的约56 kΩ，原因是µECoG设计中较短的连接线电阻较低。约39%的电极在平均阻抗的±10%范围内。分布的标准差（SD）（7.7 kΩ）相对较高（均值的19.8%），源于阵列中不同电极的PEDOT:PSS连接线长度差异。跨多个器件测量的电极阻抗（图S4，支持信息）表明，较长（较短）的走线与较高（较低）的平均阻抗相关。当器件后来进行测试时，这种可变性并未导致神经元记录性能下降。然而，由于较长的走线在电极阻抗中导致增加的电阻贡献，与较短的走线相比，需要更高的电压来实现相似的刺激电流。
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2.2 PEDOT:PSS电极实现来自大脑表面的单神经元电生理学
为了验证器件性能，我们将µECoG阵列植入大鼠的感觉运动皮层，硬膜下放置，如图2a所示。阵列的疏水和超柔性特性使其与大脑的弯曲表面实现贴合接触。注意，由于记录区域中的PEDOT:PSS电极和走线是光学透明的，阵列下方的大脑组织和血管清晰可见。对类似厚度的PEDOT:PSS涂层聚对二甲苯C薄膜进行的紫外-可见光谱分析显示，在可见光谱中透明度为85%至60%（图S5，支持信息）。类似的透明电极此前也已为体外和体内使用而开发和表征。在手术结束时，我们通过在动物从麻醉中恢复时进行电记录来验证阵列的功能。异氟烷已知会强烈抑制自发性神经活动。图2b中的频谱图显示，在1.75%异氟烷下手术期间，低频神经活动（<约40 Hz）在一定程度上持续存在，并随着麻醉开始消退而增强并扩展到更高频率（图2b中约120 s）。这验证了阵列记录自发性神经活动的能力。我们在植入后的几天内对自由移动的动物进行了进一步的电生理学，以进一步表征微电极的性能。图2c显示了自发性皮层活动的快照：来自阵列中两个记录位置的局部场电位（LFP）和高频信号。由于阵列中电极的相对较大分布（约2.5 mm × 2.5 mm中的32个电极），每个电极从其各自位置记录了不同的LFP。电极还记录了显著的细胞外动作电位，如图2c所示的高频信号（500–3000 Hz）中。在低噪声背景信号内的高活动期与动物在开放区域移动时的肢体运动相关。例如，通过模板匹配对电极（ii）进行尖峰分类，揭示了来自推定神经元的几种不同尖峰波形（图2d，上行）。每个推定神经元的可区分尖峰活动模式从其各自的尖峰间隔（ISI）直方图中清晰可见（图2d，下行）。
图2. 植入的µECoG阵列记录来自大脑表面的细胞外动作电位并识别推定神经元。a）植入期间拍摄的图像，显示放置在老鼠大脑上的柔性和可贴合阵列。光学透明的PEDOT:PSS走线和电极提供了阵列下方大脑组织和血管的清晰视图。顶部U形边界（黑色箭头）用作参考电极。小脑螺钉用作替代参考。比例尺：2 mm。b）手术结束时神经记录的频谱图表示，显示随着动物从麻醉中恢复（t > 225 s），高频活动的出现。此处，宽带记录经过滤波以去除50 Hz噪声及其谐波。c）第11天植入后µECoG阵列不同区域（i和ii）的代表性LFP和高频（HF）记录轨迹，显示明显不同的活动模式。d）从（c）中电极（ii）识别的推定神经元的尖峰波形（上）和ISI直方图（下）的概述。尖峰波形中的形状轮廓表示SD。
位于大脑表面，传统的ECoG阵列只能记录大型神经元集群（最多100–200 Hz频段的LFP），因为来自单个神经元的信号在到达电极之前已经衰减。但由100 µm² PEDOT:PSS涂层Au微电极组成的Neurogrid和相关阵列过去已展示了来自表面记录的细胞外动作电位。在此，我们验证了更大的、约900 µm²裸PEDOT:PSS电极具有类似的能力。
应该注意的是，如图S6（支持信息）所示，阵列的记录性能随时间下降。与第0天（植入后立即）相比，几个电极的阻抗在第4天和第11天增加到>1 MΩ。这已知是由于电极与皮层的接触丧失，而非电极本身的降解，因为某些在第4天高阻抗的电极（例如15和16）在第11天恢复到低阻抗状态的事实证明了这一点。与皮层的接触丧失可以通过在阵列顶部添加止血层（如Gelfoam）来补救，以防止与用于闭合颅骨切开术的硅胶粘附。
2.3 µECoG阵列在结合电生理学和MRI中的应用
我们测试了µECoG阵列的MRI兼容性，以评估其在临床级脑成像中的相关性。µECoG阵列被植入小鼠的一个半球的硬膜下，大致位于感觉运动皮层。MRI在植入后2至10天之间进行。因此，我们通过免疫组织学在这些时间点评估了植入物引起的异物反应（图S7，支持信息）。我们在植入部位观察到来自小胶质细胞浸润的炎症，但在植入后7天没有形成星形胶质细胞丰富的瘢痕组织，证实了器件产生了最小反应。在恢复实验中确认了良好的器件功能和组织健康后，我们评估了器件与MRI的兼容性。在MRI期间，首先使用T2加权序列：快速弛豫增强采集（Turbo RARE）获取大脑的解剖图像。大脑体积以约600 µm间隔的冠状切片进行分割。在跨越颅骨切开术长度的切片中，在植入部位附近观察到成像伪影（图S8，支持信息）。图3a显示了大脑代表性冠状切片MR图像，突出了信号受损区域。这些伪影是典型的磁化率差异，并通过在畸变图像中测量其最大范围在动物间进行了量化。伪影尺寸发现为0.68 ± 0.12 mm（均值 ± SD，n = 3次扫描，3只动物）。这与最近在3T MRI扫描仪中测试的较厚和较大人体尺度ECoG阵列报告的0.89 mm伪影相比。此处使用的9.4T超高磁场MRI提供了更高的分辨率，尽管具有更大的磁化率伪影风险，但我们报告了更小的畸变。随后，我们还评估了器件与功能MRI（fMRI）的兼容性，fMRI是神经科学研究中常用的技术。使用T2*梯度回波序列（TR/TE 1000/16.5 ms）进行BOLD fMRI。图S9（支持信息）显示了3个连续大脑切片的BOLD图像，其中磁化率伪影比解剖图像更严重。基于回波平面成像的fMRI序列快速获取大脑图像，在相位编码方向具有低带宽，因此对磁化率效应的敏感性远大于Turbo RARE等解剖MRI序列。
图3. µECoG阵列在解剖MRI中引起最小畸变，并实现与神经调节的同步fMRI。a）小鼠大脑冠状切片的T2加权图像，显示植入的阵列（箭头）。箭头指示在植入部位观察到的伪影边界。比例尺：2 mm。b）同步电刺激和BOLD fMRI采用的实验范式。此处，"刺激"进行5 s，随后"休息"25 s。作为RF干扰的对照，在扫描开始时，放大器已通电但未传递刺激。这被描述为"对照"间隔。fMRI采集在整个持续时间内不间断进行。c）电刺激后冠状切片的BOLD活动图。响应计算为刺激和对照条件之间的差异。选择Z分数 > 2.5（对应p值0.006）阈值的区域。比例尺：2 mm。d）来自植入阵列附近突出区域的BOLD信号时间序列。图中前5 s表示"激活"期，此时进行刺激或对照。激活期后接"休息"期（此处显示25 s中的前10 s）。数据以均值 ± SD呈现，来自1只动物的n = 5对照和n = 10刺激期。对激活（5 s）和休息（10 s）持续时间的归一化BOLD强度评估显著性。
MEA是神经科学中特别强大的工具，因为它们不仅能够记录神经活动，还能通过电刺激来调节神经活动。将电神经调节与MRI结合将代表脑回路研究中的一种新的强大模型，迄今为止，这两种技术之间缺乏兼容性限制了该模型。我们通过传递皮层刺激并通过BOLD fMRI观察神经反应，评估了µECoG阵列支持MRI期间神经调节的潜力。我们发现，当电生理学放大器处于活动状态时，即记录或刺激时，杂散RF干扰会在MR图像中引起拉链伪影。为了减轻这种干扰的混杂效应，我们遵循了图3b所示的实验范式。在最初的几个间隔（洋红色）中，放大器被打开但未传递刺激。这产生了干扰，并作为对照条件，相对于后来传递刺激的间隔（绿色）。对照或刺激事件（约5 s）大约每30 s重复一次，并由休息期隔开。MR扫描在整个持续时间内继续。这种交错刺激/对照和休息的方法对BOLD fMRI有效，因为血流动力学反应缓慢（峰值约2 s），并且在麻醉下进一步延迟。我们使用广义线性模型（GLM）通过比较刺激和对照条件之间的效应来评估皮层刺激的影响。图3c说明了大脑冠状切片中具有显著活动变化的区域（Z分数 > 2.5，对应未校正p值0.006）。在实验期间，动物维持在浅麻醉状态（1%异氟烷），以在一定程度上保留大脑活动。我们在植入部位附近观察到热点，以及对侧半球的间接效应。图3d显示了热点的归一化BOLD信号强度，无论是否存在刺激。最初的5秒，称为"激活"期，对应于施加刺激或干扰（对照）时。随后的10秒构成放大器不活动的静息状态。对于静息状态，刺激和对照之间的归一化BOLD信号没有显著差异（p = 0.597）。当传递刺激时，与单独干扰相比观察到较低的平均BOLD信号（p = 0.017）。由于1 s的时间分辨率有限，BOLD信号在整个5 s刺激/对照和10 s休息期间取平均以评估统计显著性。我们以约3 Hz的频率手动控制电刺激。较低的BOLD信号暗示了神经活动的抑制，这是对低频皮层刺激的已知反应。总之，这些实验验证了PEDOT:PSS µECoG阵列的MRI兼容性。同时，它们展示了将电生理学与MRI结合使用的案例。
三、讨论
PEDOT:PSS涂层微电极因其比金属替代方案更低的电化学阻抗而成为高分辨率神经信号记录的最先进技术。在先前的研究中，裸PEDOT:PSS电极通过光刻和RIE在刚性基板上进行图案化，以实现可重复和可扩展的制造。在此，我们采用相同的图案化工艺来制造用于体内应用的柔性和可贴合µECoG阵列。µECoG阵列能够从大脑表面进行高度选择性的单神经元记录。高度选择性的单神经元记录得益于PEDOT:PSS电极改善的SNR。尽管先前PEDOT:PSS涂层Au电极的例子已展示了单神经元记录，但使用导电金属走线来降低整体电极阻抗和小电极面积（100 µm²）被认为对于实现这种性能水平至关重要。在此，裸PEDOT:PSS微电极尽管缺乏记录电极位点的金属且表面积更大（900 µm²），但仍保留了从皮层表面记录单个动作电位的能力。虽然小电极尺寸对于获得单神经元分辨率很重要，但它们并非唯一因素。研究人员强调，记录质量取决于信号来源（例如来自胞体或轴突）及其相对于电极的位置以及背景活动水平。来自脑切片的记录显示，面积为1至196 µm²的电极最适合测量轴突动作电位，而较大的64至1024 µm²电极最适合测量来自胞体的更强信号。基于计算研究，研究人员还使用40 µm直径（1256 µm²）的电极进行来自海马体的体内记录。因此，我们推断PEDOT:PSS微电极检测附近神经元在胞体或轴突初始段产生的强动作电位尖峰。
电生理学和脑成像已被确定为神经科学中的互补工具，允许跨不同空间和时间尺度获取神经信息。基于这一观点，我们此前已表明，完全省略神经电极中的金属层并使用PEDOT:PSS代替，可提供透明电极，可用于同步光学显微镜和电生理学。金属电极也因周围组织加热和成像伪影而与临床脑成像（如MRI）根本不相容。在此，我们将无金属PEDOT:PSS电极转化为µECoG阵列，该阵列在高达9.4T的磁场下与MRI兼容。来自植入阵列的伪影在解剖MRI中限制为0.68 ± 0.12 mm，但在BOLD fMRI序列中更严重。此处使用了先前优化为具有足够光学透明度和低阻抗的380 nm PEDOT:PSS薄膜。较厚的薄膜有望改善记录的信噪比和刺激能力，而不会影响MRI兼容性。µECoG阵列由4 µm厚的聚对二甲苯C制成，聚对二甲苯C是一种碳基材料，因此其磁化率预计接近生物组织。阵列的设计考虑了电生理学期间额外的光学显微镜。因此，Au走线位于距记录区域约2.5 mm处，以提供透明窗口。然而，厚度为100 nm、最大宽度为100 µm的薄膜Au，尽管具有不同的磁化率，但引起的B0场畸变可忽略不计。薄膜对B1场的屏蔽也不足以导致MR信号损失。因此，将Au走线延伸至电极位点将改善电极阻抗，而大概不会影响MRI。这些畸影几乎肯定是手术本身的影响，而非直接由植入物引起。用硅胶和牙科水泥密封颅骨切开术会在植入部位附近留下充满液体的腔隙。水泥在凝固过程中也可能掺入气泡。这些畸变可能通过用磁化率匹配的凝胶覆盖该部位以排除O2来改善。
除了记录神经活动外，在fMRI期间传递精确的电刺激在脑映射应用中具有优势。它对于大多数在MRI扫描期间处于麻醉状态的动物模型特别有用，执行任务或躯体感觉刺激可能不可行。因此，我们研究了µECoG阵列是否能在MRI扫描期间支持神经调节。然而，当电生理学放大器处于活动状态时，电磁干扰会在MR图像中产生伪影。为了减轻这一点，我们在BOLD fMRI扫描连续运行时交错"刺激"和"休息"期。在休息期间，放大器未通电。我们还引入了额外的"对照"期，此时放大器处于活动状态但未传递刺激。来自对照期的这种伪影作为刺激间隔的参考。这些期间持续5 s（用于刺激和对照）到30 s（用于休息），这与血流动力学反应的速度相关。有趣的是，在刺激期间，与单独干扰相比出现了较低的平均BOLD信号，暗示了植入部位附近神经活动的抑制。这种现象与先前展示的对低频皮层刺激的神经反应一致，但通过表面电极进行刺激的实例在文献中很少。我们将刺激/对照期限制为5 s。由于血流动力学反应在麻醉下延迟，在当前同步电生理学和BOLD fMRI的实验范式中，更长的期间将是有益的。我们认识到需要更多动物中的额外研究来更好地理解伪影的性质并验证低频皮层表面刺激的效果。尽管这种实验设置可以解码对刺激的神经反应，但它也强调了电生理学硬件的实际局限性。定制的放大器和屏蔽导体有望改善干扰问题。
总的来说，我们的实验验证了PEDOT:PSS µECoG阵列的MRI兼容性，同时展示了它们在执行同步电生理学与MRI方面的实用性。这项技术为神经科学研究增添了新的维度。
四、实验部分
4.1 柔性µECoG阵列的制造
µECoG阵列在承载Si晶圆上的聚对二甲苯C基底上制造。首先，使用化学气相沉积在Si上沉积2 µm厚的聚对二甲苯C薄膜（Labcoter 2，Speciality Coating Systems，USA）。为了图案化Au走线和触点，使用AZ 5214E图像反转光刻胶（Microchemicals GmbH，Germany）进行光刻（掩模对准器MA/BA 6，Suss MicroTec，Germany）。图案化基底在O2等离子体（FEMTO，Diener electronic GmBH，Germany）中于1 mbar压力和100 W功率下清洁1 min。通过电子束蒸发（Kurt Lesker，USA）沉积Ti（10 nm）和Au（100 nm），随后在丙酮中剥离。
PEDOT:PSS事先按以下配方制备：94.5%（v/v）Clevios PH 1000（Heraeus，Germany）、5%（v/v）乙二醇和约0.5%（v/v）十二烷基苯磺酸（DBSA）。混合物经超声处理，在使用前加入1 wt.%（3-缩水甘油氧基丙基）三甲氧基硅烷（GOPS），并使用PTFE过滤器（0.45 µm孔径）过滤混合物。晶圆在O2等离子体（1 mbar压力，100 W，1 min）中活化，混合物通过多步旋涂并配合短中间烘烤步骤以获得约380 nm厚的薄膜。最终薄膜随后在热板上于110 °C烘烤1 h，并在DI水中浸泡过夜以去除过量PSS和低分子量化合物。使用AZ 5214E作为正性光刻胶，通过光刻定义光刻胶刻蚀掩模（约1.4 µm）。随后使用CF4和O2（分别为5和50 sccm流速，60 mTorr压力和150 W功率）的反应离子刻蚀（RIE）对PEDOT:PSS层进行刻蚀。刻蚀速率先前已优化，以避免过度刻蚀到底层聚对二甲苯C基底。这定义了记录电极和与Au走线的互连。
在用丙酮冲洗剩余光刻胶后，用[3-（甲基丙烯酰氧基）丙基]三甲氧基硅烷（A 174 Silane，Sigma Aldrich，UK）处理晶圆，以改善聚对二甲苯C绝缘层和基底层之间的粘附性。为此，样品在温和O2等离子体（1 mbar，25 W，1 min）中活化，在3%（v/v）A 174溶液（在96%乙醇中制备，含1%乙酸）中浸泡30 s，并用乙醇冲洗。用氮气（N2）干燥并在70 °C烘烤1 h。接下来沉积与基底相同厚度（2 µm）的聚对二甲苯C绝缘层。使用厚光刻胶（AZ 10xT，Microchemicals GmbH，Germany）进行轮廓光刻，以在晶圆上分离单个阵列。随后进行RIE（O2 50 sccm，CF4 8 sccm，六氟化硫（SF6）2 sccm，60 mTorr压力和180 W功率）以刻蚀4 µm聚对二甲苯C。电极和触点以类似方式通过刻蚀2 µm厚绝缘层进行图案化。刻蚀时间先前已优化以精确控制深度。
完整阵列使用DI水从Si晶圆上释放，并转移到显微镜载玻片上进行封装。阵列通过使用各向异性导电胶膜（ACF）胶带（5 µm颗粒尺寸，TGP5010，Telephus Inc.，Korea）在贴片机（FINEPLACER pico，Finetech GmbH，Germany）中连接柔性印刷电路连接器（FPC）进行封装。
4.2 电极的电化学表征
1 kHz阻抗在键合后使用Intan Technologies的Intan RHS刺激/记录系统和RHS头级（相对于大Au电极）测量所有电极。从选定器件的随机电极使用恒电位仪（Metrohm Autolab BV，Netherlands）通过EIS（Pt线作为参考和对电极）进行表征。所有测量在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行。EIS测量使用Python中的impedance.py包拟合到改进的Randles电路。
4.3 µECoG阵列在动物中的植入
µECoG阵列植入大鼠和小鼠，所有程序均按照英国动物（科学程序）法1986进行，在项目许可证PFF2068BC下，并经剑桥大学动物福利和伦理审查机构批准。器件在植入前通过在70%乙醇中浸泡约20 min进行消毒，随后用无菌细胞培养级水和PBS多次洗涤。洗涤后，器件风干并储存在无菌培养皿中。所有这些步骤均在无菌层流罩中进行。
为了测试电生理学能力，探针在3轮中植入6只大鼠（雌性，Lewis品系，Charles River UK）。动物用5%异氟烷（在O2中）麻醉，手术期间降至2.5%。动物头部固定在立体定向框架上，钻孔开颅，并去除感觉运动皮层上的硬脑膜（Bregma坐标：前后-1至-4 mm，AP，和中外侧1至4 mm，ML）。包含一个小脑螺钉用作参考电极。ECoG阵列放置在皮层上，颅骨切开术用薄层医用硅胶（Kwik-Sil，World Precision Instruments）闭合，最后用牙科水泥将头帽附着到颅骨。3D打印头帽用水泥固定在颅骨上，以容纳FPC电缆以及定制的ZIF-to-Omnetics印刷电路板（PCB）和来自小脑螺钉的参考线。前两轮（4只大鼠）用于优化手术和头帽安装。在2只动物中，头帽在恢复后不久脱落，不得不安乐死。在另外2只大鼠中，FPC电缆被动物损坏。这4只受试者的任何记录都不可靠，因此被排除。
MRI实验在小鼠上进行，因为可用头线圈的大小。动物如前所述麻醉，在一个半球的感觉运动皮层上钻3 × 3 mm颅骨窗口，坐标如下：-1 mm至2 mm AP和0 mm至3 mm ML。创建从前到后延伸、延伸至后肢的皮下来隐藏FPC。FPC插入囊中，µECoG的记录区域放置在大脑表面。颅骨窗口用医用硅胶闭合，随后用牙科水泥。FPC的末端可以通过切开后肢皮肤暴露以进行记录。
对于初步验证，使用了5只小鼠（雌性，C57BL/6品系，Charles River UK）；其中3只植入µECoG（不带FPC电缆），其他属于假手术组，未进行手术。MRI在植入后7-10天进行。该实验的目的是确定植入阵列是否适用于MRI程序。在下一个实验中，使用了3只小鼠，省略了医用硅胶，在放置µECoG阵列后将颅骨窗口放回，随后涂抹水泥。根据动物福利指南，1只动物在手术后1周因缝合线开裂而不得不安乐死。这些小鼠的MRI显示非常强的伪影并被拒绝。将颅骨放回以闭合颅骨切开术可能截留了导致伪影的气泡。在另一次重复中，使用了3只小鼠，并再次采用用硅胶和水泥闭合颅骨切开术的初始方法。这次，MRI实验在手术后2-4天进行。对全部3只动物进行了解剖MRI，仅在1只动物中进行了同步fMRI和电生理学作为概念验证实验。
4.4 免疫组织化学
大脑在植入后7天收集，并转移到4%无甲醇多聚甲醛PBS-Azide（含0.1%叠氮化钠的PBS）中，在4 °C下放置48 h。然后转移到30%蔗糖PBS-Azide中，浸泡至组织下沉（约72 h）。使用冷冻切片机切割10 µm切片并安装到显微镜载玻片上。载玻片保持冷冻直至染色，并在室温下解冻15 min。组织在5%驴血清PBS-Azide中于室温下封闭1 h。随后，在4 °C下与一抗孵育过夜。抗GFAP抗体（ab7260，AbCam，UK）以1/1000使用，抗TMEM119抗体（ab209064，AbCam，UK）以1/500在5%胎牛血清PBS-Azide中使用。组织用5%胎牛血清（FBS）PBS-Azide洗涤三次。接下来在5% FBS PBS-Azide中以驴抗兔IgG Alexa Fluor 555（1/500）和驴抗小鼠IgG Alexa Fluor 488（1/2000稀释）在室温下避光孵育3 h。组织用5% FBS PBS-Azide洗涤三次，再次在Vector TrueVIEW自发荧光淬灭试剂盒中于室温下孵育3 min。最后，用5% FBS PBS-Azide洗涤，并用1 µg/mL DAPI（在5% FBS PBS-Azide中）处理5 min。使用ProLong Gold抗淬灭封片剂（Thermofisher，UK）盖玻片覆盖组织。成像在Zeiss Axioscan 7显微镜中进行。
4.5 大鼠的恢复电生理学
恢复电生理学记录从植入后第4天至2周在清醒动物上进行。使用Intan Technologies的记录/刺激控制器、32通道RHS头级和采集软件（Intan RHX）。记录使用Spike2（Cambridge Electronic Design，UK）进行分析。高频记录首先通过将原始数据在500和3000 Hz之间进行带通滤波获得。使用-4 × SD的阈值检测尖峰，并使用Spike2中的模板匹配功能分类为推定神经元。接下来通过定制的Python代码提取每个识别的推定神经元的时间戳并计算ISI直方图。此处显示的LFP通过对原始记录进行125 Hz低通滤波获得。
4.6 小鼠的MRI实验和图像分析
MRI在植入后至少恢复三天后，在9.4 T水平孔Bruker BioSpec 94/20扫描仪（Bruker BioSpin，Ettlingen，Germany）中进行。小鼠放入麻醉状态，从0.4 L min⁻¹ O2中的5%异氟烷开始，通过后肢附近的切口暴露皮下FPC连接器。在MRI期间，用1-2.5%异氟烷维持麻醉。
µECoG阵列的后端连接为MRI使用进行了定制。FPC连接器和头级之间使用长电缆，以使后者适当地位于磁边缘场孔之外。然而，作为缺点，电缆为电极增加了寄生电容。使用PD/T2加权Turbo RARE序列获取T2加权解剖MR图像。对于结合电生理学和BOLD fMRI，在传递电刺激期间进行15-20 min的连续扫描，每30 s刺激5 s。为了考虑干扰，头级在几个间隔内打开和关闭（但未传递刺激），作为对照条件。使用双相100 µA和100 µs电流脉冲进行刺激，频率手动控制约3 Hz。
首先注册20 min长扫描的fMRI图像，以避免由于呼吸运动和其他漂移引起的漂移。使用Python中的Nilearn包处理注册图像。根据我们的实验范式，创建设计矩阵以注释刺激、对照和休息切片。这用于将GLM拟合到fMRI图像。由于放大器在打开时引起干扰，刺激和对照事件之间的差异被视为电刺激的效果。通过识别大脑冠状切片中刺激效果与休息事件显著不同的区域来创建大脑的激活图。使用Z分数 > 2.5（对应p = 0.006）。为了比较刺激和对照条件的BOLD时间进程，对绝对BOLD强度进行归一化。为了统计比较刺激和对照条件的归一化BOLD时间进程，将前5 s（即刺激/对照持续时间）和接下来10 s（即休息持续时间）的强度一起考虑。
4.7 统计分析
对于电极阻抗分析，考虑了来自3个批次的12个器件。在总共384（= 12 × 32）个电极中，选择了343个阻抗 < 1 MΩ的有源电极。使用10 kΩ的箱宽创建直方图。在Origin软件中进行高斯拟合，结果报告为拟合分布的均值 ± σ。
对于解剖MRI中伪影大小的量化，使用了来自3只动物3次扫描的图像。结果以均值 ± SD呈现。
BOLD fMRI分析使用Python中的Nilearn包进行。拟合GLM后，使用Z分数 > 2.5（对应p < 0.006）来量化刺激和对照条件之间的对比。这是从1只动物的概念验证实验中的20 min扫描计算的。15 s（刺激/对照5 s和休息10 s）的BOLD时间进程相对于t = 15 s（即30 s重复周期的中心）进行归一化。通过一起考虑前5 s（即刺激/对照持续时间）和接下来10 s（即休息持续时间）的强度来比较刺激和对照条件的BOLD时间进程。使用Python中的SciPy包进行独立t检验。
