一、蛋白纯度
重组蛋白经过表达和纯化后，首先需要确认样品中是否以目标蛋白为主要成分。这里所说的“纯度”，本质上是目标蛋白在整个样品中的相对占比。
最常见的判断方式是SDS-PAGE。将蛋白样品进行变性后，不同分子量的蛋白在凝胶中分离形成条带。如果目标蛋白对应位置出现明显主带，其他位置的杂带较少，通常可以初步判断样品具有较高纯度。
但SDS-PAGE并不能覆盖蛋白质量评价的全部内容。一条清晰的主带可以说明样品组成比较简单，却不能直接说明所有目标蛋白都处于相同的聚集状态，也不能仅凭条带确认蛋白的精确分子量和氨基酸组成。
在实际的重组蛋白分析中，SDS-PAGE更像是第一层筛查，SEC和质谱则进一步回答蛋白“以什么状态存在”和“究竟是什么分子”。
蛋白纯度
二、SDS-PAGE看蛋白纯度
SDS-PAGE最直观的信息来自蛋白条带。如果目标蛋白理论分子量为50 kDa，电泳后在接近50 kDa的位置出现一条明显主带，同时其他分子量区域没有明显杂带，通常说明样品中目标蛋白占比较高。
如果目标位置出现多条相近条带，则需要进一步考虑蛋白降解、不同修饰状态、剪切或其他形式的异质性。如果在目标条带之外还存在较多高分子量或低分子量条带，则说明样品中可能存在聚集体、降解片段或宿主来源杂蛋白。
不过，SDS-PAGE上的“纯度”需要结合染色方法和定量方式理解。肉眼看到一条主带，并不等同于严格意义上的95%或98%纯度。实际报告中的纯度数值通常来自对条带灰度等信号进行分析。
还需要区分理论分子量与电泳表观分子量。蛋白在SDS-PAGE中的迁移位置并不总是与理论值完全一致，尤其是膜蛋白、带有特殊结构域的蛋白、糖基化蛋白以及部分高度带电蛋白，可能出现明显的迁移偏差。
三、SEC看蛋白是不是“单一状态”
SEC，即体积排阻色谱，也常被称为凝胶过滤色谱。它按照蛋白或蛋白复合物在溶液中的有效尺寸进行分离，因此能够提供SDS-PAGE难以获得的信息。
对于一个状态较稳定的可溶性蛋白，SEC通常会出现相对集中的主峰。如果目标蛋白主要以单体存在，主峰的位置可以与预期的单体状态相对应。
如果主峰之前出现明显的高分子量峰，往往提示样品中存在二聚体、寡聚体或更大的聚集体；如果主峰之后出现小分子峰，则可能存在降解片段或其他低分子量组分。
SEC的一个重要特点是，它观察的是蛋白在溶液状态下的分子分布。SDS-PAGE经过变性处理后，蛋白通常以线性多肽形式进行分离，而SEC分析的是天然或接近天然条件下蛋白的溶液状态。这两个结果出现差异并不奇怪。
例如，一个蛋白在SDS-PAGE上只有非常干净的一条主带，但SEC却出现明显的高分子量峰，这可能说明蛋白在变性电泳条件下表现正常，而在溶液中存在聚集或寡聚化。
四、质谱主要确认蛋白的身份和分子组成
蛋白质谱可以通过精确分子量分析以及肽段鉴定，对目标蛋白身份进行确认。对于经过胰蛋白酶等酶切后的样品，还可以通过肽段与理论序列进行匹配，从而确认样品是否包含目标蛋白对应的序列信息。
在重组蛋白质量分析中，质谱常用于确认几个关键问题：样品是不是目标蛋白、实际分子量是否与理论值一致、是否存在明显的截短或加工形式，以及部分翻译后修饰是否能够被检测到。
如果理论分子量与实测质量存在差异，需要结合蛋白本身的特点进行解释。His-tag、Fc、信号肽、连接肽等序列都会影响最终分子量；糖基化、磷酸化等翻译后修饰也可能使实测质量与单纯按照氨基酸序列计算的理论值产生偏差。
五、SDS-PAGE、SEC与质谱为什么需要结合起来看
三种方法实际上对应了三个不同层面的信息。
SDS-PAGE看样品组成和条带表现；SEC看蛋白在溶液中的分子状态；质谱看蛋白的分子身份和质量信息。
例如，一个重组蛋白SDS-PAGE显示约97%的纯度，主带清晰，表面上已经是比较理想的样品。但如果SEC显示明显的高分子量聚集峰，那么这个蛋白的溶液状态仍然值得进一步关注。
反过来，如果SDS-PAGE存在一条主要条带，SEC也只有一个主要峰，但质谱检测发现实际分子量与理论值存在较大偏差，则需要进一步确认蛋白是否发生了截短、加工或其他分子变化。
还有一种情况是SDS-PAGE出现多个条带，但质谱确认这些条带都来源于目标蛋白。这时问题可能并不是传统意义上的“杂蛋白污染”，而可能与蛋白降解、剪切、修饰或不同分子形式有关。
六、蛋白纯度与蛋白质量的关系
蛋白纯度主要描述样品的组成情况，而完整的蛋白质量评价还涉及分子状态、结构完整性、聚集情况以及翻译后修饰等多个方面。对于重组蛋白而言，即使样品中目标蛋白占比较高，不同分子状态仍然可能影响最终的实验表现。
其中，蛋白聚集、降解和寡聚化是比较常见的分子状态。聚集蛋白在SDS-PAGE变性条件下可能解离成单体条带，电泳结果看起来较为干净，但SEC能够进一步观察溶液中的高分子量组分。类似地，蛋白发生部分降解后，SDS-PAGE可能出现低分子量条带，质谱则可以进一步帮助确认是否存在截短或特定肽段缺失。
蛋白的天然寡聚状态也需要结合具体蛋白进行判断。某些蛋白以单体形式发挥功能，而另一些蛋白天然存在二聚体、三聚体甚至更高阶复合物。SEC中出现多个峰，并不能直接等同于样品纯度下降，需要结合蛋白本身的结构特征和已知分子状态进行分析。
对于糖蛋白等具有翻译后修饰的重组蛋白，理论分子量与实际检测结果之间也可能存在差异。蛋白的糖基化、二硫键以及其他修饰会改变分子质量和构象特征，这类信息单靠SDS-PAGE通常难以完整呈现，需要结合质谱等分析手段进一步确认。
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