在ELISA实验中，TMB底物液的使用是一个容易被忽视却又至关重要的环节。许多实验者习惯将A液和B液混合后放在一旁，等需要时再取用。但混合液的稳定性远低于未混合的组分，忽视这一点的代价常常是整板本底升高、检测限受损。
以下从混合液的化学变化、变色后的处理方法以及正确使用原则三个方面展开说明。
TMB底物液通常由A液（含TMB）和B液（含过氧化氢和缓冲液）两部分组成，分开储存时各自相对稳定。一旦混合，TMB和过氧化氢便处于同一体系之中。在无HRP催化的情况下，过氧化氢仍会以缓慢的速率氧化TMB，生成蓝色产物。这一非酶氧化反应是持续进行的，只是速率较低。
混合液的保存时间受多种因素影响：微量金属离子（如Fe³⁺、Cu²⁺）可催化TMB的氧化，加速变色过程；光照会加速过氧化氢分解和TMB氧化，混合液应避免暴露于直射光；温度升高时氧化速率显著加快——在室温下放置数小时的混合液，其变色程度可能比4℃条件下放置同样时间的混合液高得多。
因此，底物液混合后并非处于静止状态，而是进入了一个缓慢但持续的自显色进程。
混合液出现蓝色，说明TMB已经发生了氧化反应，溶液中已经存在蓝色产物。此时是否还能使用，取决于变蓝的程度。
- 如果说明书明确指出“轻微变蓝不影响使用”，且蓝色极浅（仅与空白管对比时勉强可辨），则可以参考说明书规定使用。
- 说明书未明确说明时，保守的做法是：肉眼可见任何蓝色，即弃用重配。
变蓝后使用的后果：加入酶标板后，所有孔的本底信号被均匀抬高。标准曲线低端和空白孔的吸光度读数明显高于正常水平，导致检测限升高和定量准确性下降。尤其是低浓度样本和接近检测下限的临界值样本，其测定结果不可靠。
三、正确使用和保存方法- 未混合前，A液和B液应按照说明书要求分别储存在2-8℃避光条件下。
2. 混合时，按当次实验所需体积现配现用，不多配、不储备、不反复取用同一管混合液。
3. 如需分多块板显色，建议分次配制，而非一次性配制大量混合液后分批使用。
4. 使用干净的容器和吸头配制混合液，避免引入金属离子或残留的HRP污染——即使是极微量的酶，也会大幅加速底物的氧化，导致混合液在短时间内变色。
5. 混合后应立即使用。如需短暂等待（如多块板操作之间的时间差），可将混合液置于冰上避光保存，等待时间应控制在说明书允许的范围内。
如果发现底物混合液已变蓝但已经加样，建议做以下处理：
- 显色后立即记录空白孔的OD值，并与历史正常范围进行对比。
- 如果空白孔读数明显高于历史均值（如高出0.05以上），该板的数据应谨慎解读，尤其是低浓度样品的结果不宜直接采用。建议在实验报告中注明底物液使用前已变色，以便解释可能的异常低值。
如果频繁出现混合液快速变蓝的情况，建议：
- 检查A液和B液的储存条件是否符合说明书要求（温度、避光、瓶口密封），确认是否曾暴露于高温或直射光。
- 确认配制混合液时使用的容器和吸头是否清洁干燥，有无接触金属表面或HRP残留。
- 如有条件，用新鲜更换的底物液批次做平行测试，以排除该批次产品本身的问题。若问题持续，建议联系技术支持并提供批号、储存条件和变色时间记录，以便判断是储存问题还是批次质量问题。
