正面回复！饶毅逐条回应PubPeer九点质疑(饶毅致辞)

文章来源：睦科生物公众号

近日，PubPeer平台上针对饶毅团队2025年1月发表于《Communications Biology》的睡眠研究论文《Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II α and β differentially regulate mammalian sleep》出现多项数据质疑。9月9日，饶毅教授对PubPeer上的9点评论或质疑做出正式回应。

根据公开信息，PubPeer上的质疑主要涉及以下4类：

• Western blot灰度值小数尾数重复：Figure 1C、1D和Figure 2G的部分灰度值具有相同小数尾数，被质疑数值异常。
• episode数据高度相似：Supplementary Figure S2中，Wake episode number与NREM episode number存在大量高度相似或完全一致的数值。
• 数值呈现固定关系：Figure 2C中6个连续时点保持y=x-10.5的固定关系。
• 水迷宫数据跨表逐项一致：Figure S1A与S1B的Morris水迷宫逃逸潜伏期数据中，6只WT小鼠连续5天的30个数值跨表完全相同。

一、关于Western blot灰度值中部分小数尾数重复的问题（Pubpeer comment#1-3）

评论者注意到Figure 1C、1D 和Figure 2G 的部分Western blot灰度值数值具有相同的小数尾数，并据此认为这些数值“统计上异常”。

这些数值来自图像灰度定量过程，Western blot 定量值受图像灰度、ROI、像素数量、背景扣除以及软件计算和输出精度等因素共同影响。判断这些结果是否可靠，应当回到原始胶图，而不能仅依据数值末位模式进行判断。

回到质疑本身，本文所用的ImageJ灰度值定量方法，的确会产生相同尾数。在视频网站搜索同款定量方法教学视频时，可以看到，视频中按标准流程分析不同膜时，ImageJ 独立导出了多个小数尾数完全一致的灰度值（图1），出现在视频中2：30-3:30之间。

图1在视频网站找到的教学视频中，尾数.823以及.359在不同的条带中反复出现【研途指南：ImageJ测量western blot（WB）条带灰度值】https://www.bilibili.com/video/BV13y4y1h76s/?share_source=copy_web&vd_source=3dd48bd1f3a817a3c77a865b76ce6a17。

我们又随机找了一篇文献3随机选取了一张图用同样方法计算灰度值，也出现了大量的尾数重复现象（图2）。

图2 一篇随机文献中的胶图Fig. 4E进行计算，反复出现大量相同尾数.042, .627, .749等。

我们去检索展示了类似数据的期刊，发现一些文章对于灰度值的原始数据仅上传normalized 后用于作图的ratio，而非ImageJ 直接导出的灰度值数据4-7；一些文章是只放了未裁膜的胶，而未展示计算过程8-12。最终我们还是找到了和我们存在类似数据类型的文章13（图3）。

图3 此文章的灰度值尾数也存在高度相似的情况。同颜色标注为同样尾数。

回到本文，我们不仅放了未裁膜的胶，并且把软件直接输出的灰度值也放进了source data，并且没有四舍五入而是选择保留所有有效数字，相信我们所提供的数据量已经满足了学术发表对于WB原始数据的要求。

二、关于Supplementary Figure S2 中Wake episode number 和NREM episode number 高度相似的问题（Pubpeer comment #4-6 & 8）

部分评论将Figure S2A 与S2E，以及Figure S2C 与S2G 中dark phase 的数据进行了逐一比较，并把很多数值“完全相同”或仅相差1–2 次视为异常。这里需要说明的是，Wake episode number 和NREM episode number 并不是两个彼此独立产生的数据集。它们均来自同一只动物、同一段EEG/EMG 睡眠记录的状态序列。在连续的睡眠—觉醒状态序列中，一个Wake episode 的结束通常对应一个NREM episode 的开始，反之亦然。因此，在一定时间窗口内，Wake episode number 和NREM episode number 在数学上本来就高度耦合。

举例而言，在一个简单的

Wake → NREM → REM → Wake → NREM → Wake

状态序列中，Wake episode 和NREM episode 的数量天然只相差0 或1。实际动物睡眠还包含REM 状态，其中低频率发生的REM → NREM转换以及罕见发生的Wake → REM转换会导致差值略有变化，但两者高度接近是睡眠状态转换结构的自然结果，而不是两个“独立实验数据异常相似”。因此，评论中所强调的“相同”“相差1”“相差2”的规律，本身并不能作为数据异常的证据。

同样地，我们找到了一些和我们统计了相同指标的文章，虽然它们有些没有提供原始数据，但从柱状图以及数据点对应的趋势来讲，与我们的结果是相似的。

文章1：Effects of Social Defeat Stress on Sleep in Mice14（图4）

图4 本文Table 1中列出的number of bouts （等同于本文Episode number）在Wake和NREMS baseline完全一致。

文章2：Early-life sleep disruption in Shank3-deficient rats: A preclinical model for autism-related sleep mechanisms and interventions15（图5）

图5本文Figure 4B呈现数据中night的NREM bouts number和wake bouts number数量相近，原始数据多有相差1、相差2以及完全相等的情况（标黄数据部分）。

文章3：Chemogenetic activation of astrocytes modulates sleep–wakefulness states in a brain region-dependent manner16（图6）

图6 这篇文章没有给出原始数据，但是看Figure2 F和J图数据点分布的pattern和大致对应的数值是几乎一致的。

文章4 ：Anterior Insula Regulates Multiscale Temporal Organization of Sleep and Wake Activity17（图7）

图7 这篇文章没有给出数据点，但是Figure2 D图和E图的无论是24h、Dark还是light的平均值与误差棒是几乎一致的。

同样地，在文章5: Octacosanol restores stress-affected sleep in mice by alleviating stress18

Figure 3A三组数据，

文章6：The effect of Neuroligin-2 absence on sleep architecture and electroencephalographic activity in mice19Figure 2B三组数据，

文章7：Sparse Activity of Hippocampal Adult-Born Neurons during REM Sleep Is Necessary for Memory Consolidation20Figure 3E四组数据，

文章8：Red light at intensities above 10lx alters sleep–wake behavior in mice21Figure 2 abc三组数据和Figure 4a这些文章中的NREM episode number以及Wake episode number也存在均值与误差棒几乎一致的情况。

三、关于Figure 2C 中两列cumulative REM rebound 数据在连续时间点保持固定差值的问题（Pubpeer comment #7）

有评论指出，Figure 2C 中两只动物在连续多个时间点之间保持了固定的10.5 min 差值。这里同样存在对数据结构的误解。Figure 2C 展示的是cumulative REM rebound，即小鼠在睡眠剥夺后REM相较于剥夺前对应时间点差值的累计值，而不是每一个时间点相互独立的测量值。

在这样的计算方式下，只要两只动物在某一时间段内新增的REM rebound相同，或者这两只动物在睡眠剥夺前后的该时段完全没有REM发生，两条累计曲线此前已经存在的差值就会自然保持不变。特别是，质疑图中标注出的时间段是小鼠活动的高峰期，即使是正常小鼠该时间段REM睡眠也有为0的情况。再加上，Camk2a敲除鼠本身就有REM睡眠缺陷，被质疑的“连续六个时间点都差10.5分钟”的两只敲除小鼠，有四个时间点在剥夺前后没有REM睡眠，有两个时间点差值恰好一样（图8）。这在文章中检测的25只小鼠中并非是一个小概率事件。

图8 标绿的数据即是被质疑的数据点。

四、关于Supplementary Figure S1A 和S1B 中WT 数据完全相同的问题（Pubpeer comment #9）

Figure S1A和S1B 使用的是同一批WT C57BL/6J 小鼠（n=6）。WT、Camk2a+/−、Camk2a−/−、Camk2b+/−和Camk2b−/−小鼠在同一实验周期内完成Morris water maze 测试。作图时，为了分别展示Camk2a 和Camk2b mutant 的结果，我们将同一套实验数据分为两个panel，并将这批WT 小鼠作为共同对照。因此，S1A 和S1B 中WT 的individual escape latency data 应完全相同。

回顾这一实验设计，针对两个独立knockout line 分别使用各自的littermate WT controls 会是更加严格的设计，可以更充分地控制遗传背景和繁育环境等潜在差异。但是，这一设计局限与本评论所称的“duplicate data”是两个不同问题：两个panel 中WT 数据相同，是因为它们在设计时使用了同一批WT，而不是将一组独立实验的数据复制到了另一组实验中。

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