引言
与红外光谱（IR）不同，拉曼光谱分析始于对激发光源的选择。理论上，在非共振条件下，任何激发波长都能产生相同的拉曼特征峰位置，即拉曼位移不变。由于拉曼散射强度近似与激发波长的四次方成反比（I ∝ 1/λ⁴），因此样品的理论相对峰强具有一定可预测性。若不考虑其他因素，这通常会引导用户选择尽可能短的激发波长（波长越短，拉曼信号越强）。在实际应用中，目前最常用的两种激发波长是 785 nm 和 532 nm；只要采集参数设置得当，两者均能提供高信噪比的光谱数据。然而，针对具体样品选择合适激发波长仍非易事，其困难在很大程度上源于，不同激发波长下样品产生的背景信号可能存在巨大差异（荧光背景）。与拉曼散射不同，荧光背景强度高度依赖激发波长。较短波长（高能光子）通常更容易激发电子跃迁并产生荧光发射；当荧光发射与拉曼光谱重叠时，通常建议切换至较长波长，以便更好地从背景中分辨拉曼信号。除了需要在拉曼散射与荧光干扰之间进行权衡外，还必须考虑检测器灵敏度的波长依赖性、特定波长下可用激光功率的差异，以及光谱仪效率等问题。正是这些因素交织在一起，使得预测和选择最适合采集拉曼光谱的激光器变得并不简单。
本研究采用经验法来评估和选择用于采集拉曼光谱的激光光源。除了常用的 785 nm 和 532 nm 激发光源外，本工作还引入了中间波长 633 nm 以及位于可见光边缘的 405 nm 激发光源。这些激发光源均为市售商用产品，且具有足够窄的线宽以采集高分辨率的拉曼光谱。我们将这些光源系统地应用于五大类典型拉曼分析材料：二氧化硅基（SiO₂）材料、药物、有机聚合物、碳材料和无机盐。
二、材料与方法
2.1 化合物的选择
本研究选取的化合物类别，基于运行拉曼光谱核心设施的长期经验，对该技术所分析的材料具有广泛代表性。尽管具体化合物的筛选不可避免地带有一定主观性，但所选化合物都旨在充分体现同类材料内部的化学多样性。需要说明的是，在每一类别中确定三种化合物时，我们事先未对其拉曼光谱特征进行表征，也不了解特定激光器是否适用。在整个研究过程中，每一类别中最初选定的三种化合物即为本文最终报道的对象，未进行任何后期筛选或替换。按材料类别划分，所研究的化合物如下：
- 二氧化硅基材料：石英、钠钙玻璃和硼硅酸盐玻璃；
- 有机聚合物：高密度聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚(α-甲基苯乙烯)；
- 药物：对乙酰氨基酚、阿奇霉素和尼氟灭酸；
- 无机盐：四水合醋酸钴(II)、一水合醋酸铜(II)和二水合醋酸锌(II)；
- 碳材料：高定向热解石墨 [HOPG]、活性炭和石墨烯。
2.2 光谱采集
除非另有说明，样品均安装在不锈钢样品台上，并使用配备徕卡（Leica）显微镜和 20× 物镜的雷尼绍（Renishaw）inVia 显微拉曼光谱仪在 100–3800 cm⁻¹ 范围内采集拉曼光谱。各激发波长的系统详细参数如下：
- (785 nm)：最大可用功率 90 mW，1200 lines/mm 光栅，50 μm 狭缝大小，配备 Renishaw Centrus 2957P5 检测器；
- (633 nm)：最大可用功率 35 mW，1800 lines/mm 光栅，50 μm 狭缝大小，配备 Renishaw Centrus 2GRX02 检测器；
- (532 nm)：最大可用功率 100 mW，1800 lines/mm 光栅，50 μm 狭缝大小，配备 Renishaw Centrus 2957P5 检测器；
- (405 nm)：最大可用功率 30 mW，2400 lines/mm 光栅，65 μm 狭缝大小，配备 Renishaw Centrus 2GRX02 检测器。
由于光路损耗，实际到达样品的激光功率约为激光器输出功率的 50%，并可通过中性密度滤光片（ND 滤光片）进一步衰减。每种激发波长与系统均在静态模式下采用单晶硅标准片进行校准。在初始数据采集时，除碳基化合物外，所有样品均首先以 100% 激光功率进行测试（曝光时间 10 s，扫描 1 次）；仅在观察到肉眼可见的烧灼痕迹、光谱显示有烧灼迹象或探测器饱和时，才调低功率。对于碳基化合物，则另行进行了专门的功率研究。
与上述常规条件不同的调整包括：在阿奇霉素取向效应和样品制备（粉末 vs. 晶体）的研究中，拉曼光谱是在静态扫描模式下采集的，范围为 160 至 1920 cm⁻¹。此外，基底研究（玻璃 vs. 钢）是使用 5× 物镜进行采集的。
针对二氧化硅基材料、有机聚合物、药物以及无机盐，还利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FT-IR）采集了其红外光谱。使用带有集成金刚石 ATR 模块的赛默飞（Thermo Scientific）Nicolet iS50 红外光谱仪（配备 KBr 分束器、DTGS 检测器和 Vectra™ 干涉仪）获取红外谱图，测试参数为：在 4000 至 400 cm⁻¹ 范围内扫描 32 次，光谱分辨率为 4 cm⁻¹。
2.3. 数据分析
拉曼光谱数据采用 Renishaw 公司的 WiRE 5.6 软件进行分析，并利用 Origin 软件绘图。实验中，每种化合物至少采集并分析了两个颗粒，以确认其具有相似的光谱特征。本文正文核心分析中，代表性颗粒是基于最强信号定性选取的。其余颗粒的分析数据及详细信息详见支持信息。红外（IR）光谱数据采用 Thermo 公司的 OMNIC 软件进行分析，并使用默认参数进行了 ATR（衰减全反射）校正，数据同样使用 Origin 软件绘图。
三、 结果与讨论
3.1 基底选择与采样考量
二氧化硅基底（如玻璃和石英）常用于样品制备，因此初步对钠钙玻璃、硼硅酸盐玻璃和石英进行了研究。实验时，基底的选择容易被忽视，但却会通过贡献背景信号而显著影响数据质量。例如，置于钠钙玻璃基底上的尼氟灭酸，其拉曼光谱显示出显著荧光信号，表现为背景形状和基线抬高（图1）。这是因为采样时也采集到了玻璃信号，而玻璃在约 1000–2000 cm⁻¹ 区域表现出强荧光背景。若不进行额外处理和校正，该区域内的峰将难以解析。尽管了解特定二氧化硅基底与激发波长下的荧光带位置，有助于识别干扰较少、相对洁净的分析区域（图 S1-S3），但采用钢质基底（或类似的反射性基底）替代玻璃基底，可有效消除基底荧光问题（图 1）。
此外，优化物镜倍率也是控制基底背景干扰的重要策略。与 5× 物镜相比，20× 或 50× 等高倍率物镜具有更小的激光光斑和更浅的采样深度，能有效减少激光对玻璃基底的穿透与激发，从而降低背景荧光。然而，高倍率物镜的采样区域较小，对于粉末样品，容易引入空间差异；虽然这不利于代表整体材料/本体材料的平均信息，但其较高的空间分辨率对于拉曼成像（Mapping）却至关重要。
🔺图 1. 基底选择是拉曼采样中的重要考量。与钢基底相比，钠钙玻璃（显微镜载玻片）在尼氟灭酸（niflumic acid）的目标区域内会产生显著荧光。
3.2. 荧光与探测器灵敏度对信噪比的影响
样品荧光是拉曼光谱分析中的一个普遍存在的问题。由于荧光发射强度通常远高于拉曼散射，微弱的拉曼信号极易被高强度的荧光背景所淹没。为抑制拉曼光谱中的荧光干扰，通常建议采用波长更长的激发光源，以降低发生电子跃迁的可能性。基于这一原则，在所研究的四种激光器中，785 nm 是拉曼激发波长的最佳选择；然而，实验结果表明情况并非总是如此（对于本研究所采用的色散型拉曼光谱仪，这通常是所使用的最长波长；傅里叶变换拉曼光谱仪常采用 1064 nm 激光，但其优缺点已在其他文献中讨论过）。在图 2 中，我们证明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）在多种激发波长（包括 785 nm）下均会表现出荧光。荧光会抬高基线，从而降低信噪比，使部分拉曼谱峰被背景淹没。 材料的结构（分子结构和电子结构）以及整体纯度都会影响荧光的表现和观察。将材料的吸收光谱与激发波长进行比较，有助于判断激发光与目标材料发生相互作用的可能性（如后文所述，这种比较对靶向共振拉曼也很有用）。如果荧光来源于杂质，可采用光漂白技术（连续激光照射预处理）抑制杂质荧光，从而可能降低背景。
🔺图 2. 荧光可能显著增加拉曼光谱的背景信号，进而影响多种激发波长下的信噪比（S:N），如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）所示。
选择拉曼光谱激发光源时的另一个考虑因素是探测器的灵敏度。最常用的探测器是硅基电荷耦合器件（CCD），它们针对可见光探测进行了优化，但由于硅的量子效率限制，对较长波长的近红外光灵敏度有所下降。由于拉曼位移产生的光子能量低于激发光子，且能量差恰好等于所观测到的振动能量，因此当使用近红外光激发时，拉曼谱带可能落入探测器的极低灵敏度区域。
例如，一个拉曼位移在 2900 cm⁻¹ 处的 C–H 伸缩振动峰：
- 当使用 532 nm 激光激发时，其绝对波长出现在 629 nm 处；
- 当使用 785 nm 激光激发时，则出现在 1016 nm 处。
这种效应在高密度聚乙烯的分析中表现得尤为明显：在相近功率下，使用 532 nm 激发源采集的 C–H 伸缩振动区拉曼光谱，其信噪比比使用 785 nm 激发源时至少高 56 倍（图 3）。
然而，从光源的输出功率来看，这两种波长（785 nm 和 532 nm）依然是目前的主流选择，其最大功率分别可达 90 mW 和 100 mW，显著优于 633 nm（35 mW）和 405 nm（30 mW）等可选波长。虽然新型窄发射谱线二极管激光器的发展未来有望打破这一技术局限，但由于提高激光功率会增加样品改变或损伤的风险（如灼烧、相变及热诱导的振动谱峰漂移），盲目追求高功率的实际效用有限。
🔺图 3. 拉曼光谱中常用的硅基探测器在采用较长激发波长时，较高波数处的灵敏度会降低。图中给出了使用 532 nm 和 785 nm 激发源采集的高密度聚乙烯（HDPE）某一区域的信噪比（S:N）计算结果，以说明这一现象。
3.3. 激发波长及其对峰位置的影响
拉曼位移仅由入射光能量与散射光能量之差计算得到，因此理论上应与激光波长无关。本文对多种分析物材料进行了广泛评估，实验结果表明：在研究具有高信噪比的主要拉曼峰时，在绝大多数情况下，峰位置在不同激光激发波长下确实保持不变。图 4 中的高密度聚乙烯（HDPE）很好地说明了这一点，该材料在全部四种波长下均表现出良好的可分析性。然而，对于所评估的三种碳材料（高定向热解石墨 HOPG、石墨烯和活性炭），激发波长对峰位置具有显著影响（图 5）。
🔺图 4. 常见拉曼激发波长下峰位置基本保持不变，如图所示的高密度聚乙烯（HDPE）。数据在垂直方向上进行了任意平移（以方便对比）。
表 1 不同材料类型拉曼位移对激发波长的依赖性及其物理机制
对于 sp² 杂化碳材料，其拉曼光谱分析主要依赖于 G 带（~1580 cm⁻¹）、D 带（~1350 cm⁻¹）和 2D 带（~2700 cm⁻¹）。文献普遍认为，G 带的峰位与激发波长无关，常用于评估材料的结晶度和有序度；而 D 带由多种弱振动模式叠加而成，主要用于表征晶格缺陷与无序度。研究表明，由于双共振散射机制，不同振动模式的共振条件会随激发波长改变，因此 D 带的位置会随激发波长发生位移，具有显著的“色散特性”。作为 D 带的二阶泛音，2D 带（亦称 G' 带）同样表现出明显的色散特征。
实验结果表明，在所有三种样品中，G 带在不同激发波长下的位置变化最小。其中，高定向热解石墨（HOPG）的 G 带峰位偏差极小，仅为 ±0.6 cm⁻¹（图 5a）。鉴于 HOPG 高度有序且无缺陷的结构特性，其 D 带信号极为微弱，这与文献报道高度吻合。与之相对的是，具有色散特征的 2D 带呈现出非对称双峰形貌，并因共振条件的变化导致峰位发生大幅度位移（变化幅度约 60 cm⁻¹）。对于石墨烯（图 5b）和活性炭（图 5c），色散 D 带的位移幅度高达 30 cm⁻¹，这进一步突显了对该类碳材料进行拉曼表征时固定激发源的必要性。此外，由于荧光干扰或探测器灵敏度限制，石墨烯和活性炭的 2D 带信号往往微弱甚至缺失。这一特征虽然可能表明材料质量较低和/或高度无序，但同样说明了分析此类样品时对激发波长的依赖性。
🔺图 5. 在不同常见拉曼激发波长下，峰位发生显著变化（即不满足“峰位不变性”规律）的特例：（a）高定向热解石墨（HOPG）、（b）石墨烯和（c）活性炭。
此外，这些 sp² 碳化合物的高光吸收特性使其极易受到热效应的影响。由于振动能级布居数的变化会引起局部加热和材料膨胀，这在谱图上通常表现为峰位改变（如图 6 中活性炭所示）。这种热效应可能是可逆的。以 532 nm 激光激发活性炭为例：在最高测试功率下，样品受热导致峰位发生偏移；但当激光功率调回至低水平时，其峰位及基线均能恢复至相近状态（图 6a）。然而，热效应除了引起局部升温外，还可能引发材料损伤。例如，在使用 633 nm 激光激发活性炭时，功率循环后 G 带和 D 带的峰位均无法完全恢复，且伴随着基线抬高和峰形改变（图 6b）。
🔺图 6. 在（a）532 nm 和（b）633 nm 激发光源下采集的活性炭拉曼光谱。峰位变化（红色箭头）可能由热效应引起，分别对应：（a）可逆的受热升温，以及（b）受热与不可逆损伤的共同作用（表现为灰色箭头指示的基线抬高）。
3.4. 相对峰强的变化
晶体取向是导致拉曼测量中光谱出现巨大差异的另一个原因。由于拉曼效应受极化率张量控制（这与晶体对称性以及各晶轴独特的电子分布相关，若材料具各向异性），因此晶轴方向与拉曼激光偏振方向之间的相对取向，会改变所观测到的拉曼散射强度。当这些强度发生变化时，尤其是当谱带存在重叠时，峰位比较就会变得更具挑战性。图 7 以药物材料中的阿奇霉素为例展示了这一现象。在对阿奇霉素原料药进行分析时，由于采样自不同取向的单晶颗粒，导致在所有激发波长下测得的颗粒光谱强度存在巨大差异（为简化起见，图 7a 仅展示了 532 nm 激发源下的结果）。这种强度差异会导致重叠谱带出现表观峰位移动（apparent peak shift），若不加以解决，将会造成峰位误差。然而，通过改进样品制备方法——将阿奇霉素研磨成均匀粉末后进行实验，即可有效消除晶体取向效应的影响（图 7b）。
🔺图 7. 使用 532 nm 拉曼激发波长和 20× 物镜采集的阿奇霉素拉曼光谱。(a) 晶体取向会影响相对峰强度，从而增加不同样品间光谱峰比较的难度；(b) 将样品研磨成粉末可将晶体取向效应降至最低。
最后值得注意的是，如果激发波长与样品的电子跃迁发生共振，拉曼光谱的强度也会发生改变。这一现象正是共振拉曼光谱（Resonance Raman Spectroscopy）的基础，且通常适用于有色化合物，因为这类化合物在可见光区具有强烈的吸收。尽管本文研究的化合物中有两种是有色的（醋酸铜和醋酸钴），但并未观测到强烈的共振效应。这很可能与这些化合物在可见光区的电子跃迁类型有关：微弱的 d–d 跃迁通常不会导致显著的共振效应。然而，当共振增强成功发生时，拉曼谱带的强度可提高 10³ 至 10⁵ 倍，这使得共振拉曼光谱成为痕量分析或弱散射材料检测的理想策略。
四、结论
本文基于实证方法，系统研究了拉曼光谱测量中的激光光源选择与采样策略。在针对特定材料筛选最佳光源时，需深度权衡荧光干扰、拉曼散射强度、探测器灵敏度及光源可用功率等多重因素。本文采用四种不同的激光光源，对拉曼光谱分析中常见的五类典型材料进行了比对研究。数据表明：532 nm 激光器在多数样品中均展现出优异的光谱性能，在抑制荧光干扰、提升信噪比与灵敏度之间实现了最佳平衡；785 nm 激光器虽能有效抑制或避免荧光干扰，但受限于散射效率降低及探测器本身的响应限制，存在一定的灵敏度瓶颈；相比之下，633 nm 激光器在兼顾荧光抑制、灵敏度与散射效率时，不失为一种更具性价比的理想选择。此外，无机盐测试结果表明，405 nm 激光器虽普适性较差且易引发显著荧光，但在特定应用场景下仍具备有效采集拉曼光谱的独特价值。
