背景：
蛋白质作为生命活动的核心执行者，需要通过与其他蛋白质、核酸、小分子等发生特异性相互作用而行使自身功能。蛋白-蛋白相互作用（PPI）是指两个或多个蛋白质之间建立特定且有意图的物理接触以实现特定的生物活性，是细胞执行正常生理功能的基础。根据其周围环境的不同，蛋白质具有不同的功能和细胞角色，不同功能的蛋白质相互交错形成了蛋白质网络，网络内的蛋白质可在细胞内进行信息传递并协调细胞活动，从而完成维持生命所必需的复杂功能。深入解析目标蛋白的互作网络，解析蛋白质相互作用，是探究其生物学功能及疾病分子机制、开发靶向药物的重要前提。
目前，已有大量研究技术被用于检测蛋白互作，传统的蛋白互作鉴定方法，如蛋白质复合体免疫沉淀（Co-IP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）沉淀（Pull-down）等技术多基于体外环境进行检测。这类方法可验证两个蛋白在某个时间点和某个细胞群体中是否结合，然而依然存在明显局限性。生物医药研究对实时化、精准化的需求增加，可在活细胞内实时监测蛋白互作的荧光共振能量转移（FRET）技术应运而生，其中，荧光蛋白在蛋白-蛋白互作领域使用最为广泛。FRET基于荧光分子的特殊光学特性，可实现对分子间相互作用的原位、实时、非侵入性检测。相较于传统常规荧光技术，FRET技术具有动态可视化、灵敏度高、抗干扰能力强、放大效应强等优势，这一技术已成为生物医药基础研究中不可或缺的核心实验方法，广泛应用于蛋白互作验证、蛋白构象变化分析、细胞内信号通路追踪、药物靶点筛选等领域，为疾病机制研究、新型药物研发提供了强大的技术支撑[1,2]。
图1 Y2H[2]
原理详解
FRET的本质是一种非辐射性的能量传递现象，其依赖于两个特定荧光分子的偶极-偶极相互作用实现能量的直接转移。蛋白互作领域FRET荧光传感器通常包含供体和受体两个荧光蛋白基团，常用的荧光蛋白对包括CFP和YFP、mTurquoise2和mVenus、mWatermelon和mScarlet-I等[3,4]。当供体和受体之间保持适当距离时，两者之间会发生非辐射能量转移，导致供体荧光强度减弱，而受体荧光强度增强。FRET的实现需要满足三个前提条件：（1）供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的激发光谱须存在明显的重叠区域，才可使供体被激发后释放的能量被受体有效捕获；（2）在1 nm以下，供体与受体碰撞占主导地位，而在10 nm以上距离，供体光子发射占主导，因此供体与受体荧光团之间的空间距离须处于1-10 nm范围内才可发生FRET；（3）供体与受体荧光团的偶极子取向需处于特定的角度以保证偶极-偶极的耦合，若两者偶极子完全垂直，能量转移效率显著降低，甚至无法发生转移。
其作用过程可拆分为四步，分别为：（1）激发供体：用特定波长的激发光照射供体荧光团，使供体从基态跃迁到激发态；（2）能量转移：处于激发态的供体，将自身的能量非辐射性地转移给邻近的受体荧光团，自身则从激发态回到基态，且不发射自身的特征荧光；（3）受体发光：接受能量后的受体荧光团被激发，从基态跃迁到激发态；（4）信号检测：受体从激发态回到基态时，发射出自身的特征荧光，此时可通过荧光显微镜、光谱仪等设备检测受体荧光的强度、变化规律等。
分析方法
敏化发射法：该方法是最早实现、也最广泛应用于活细胞FRET定量的方法之一，其通过多通道成像，直接观测受体荧光蛋白因能量转移而获得增强的荧光发射信号。敏化发射意为邻近的受体荧光蛋白可通过供体荧光蛋白的能量转移发出荧光，无需被其自身激发光直接照射，其强度与FRET效率呈正相关。该方法通过设置三个检测通道（供体单独通道、受体单独通道、FRET通道），采集三组信号强度，扣除背景与光谱串扰，计算FRET效率，进而判断蛋白互作。该方法通过测量纯供体和纯受体对照样品，计算串扰系数，且每次实验需重新进行系统校正，极大增加实验工作量，这也是是限制该方法应用的主要因素之一。
受体光漂白法FRET（FRAP-FRET）：该方法通过选择性破坏受体荧光蛋白的发色团结构，利用供体荧光在去猝灭前后的强度变化反推FRET效率。实验在供体激发条件下记录供体荧光的基础强度；随后使用受体最大吸收波长的高强度激光对选定区域进行反复扫描，使受体发色团发生不可逆的光化学破坏，随后立即在完全相同的供体激发条件下再次采集供体荧光图像。由于能量转移途径被阻断，供体荧光强度将显著回升，其恢复比例即为FRET效率的直观度量。该方法结果易于理解，不受受体表达量波动的影响，且仅需标准共聚焦显微镜即可实施，但每个细胞只能进行一次测量，无法对同一细胞进行动态追踪，高强度激光亦可能引发局部活性氧产生和热损伤，导致细胞生理状态改变。
荧光寿命成像显微镜FRET（FLIM-FRET）：荧光寿命是指荧光分子从激发态回到基态所需要的平均时间，是荧光分子的固有属性，不受荧光浓度、激发光强度的影响，该方法为基于荧光寿命检测的FRET衍生方法。当供体与受体发生FRET时，供体的激发态能量会快速转移给受体，导致供体的荧光寿命显著缩短，此时可通过荧光寿命成像显微镜，分别采集单供体样品和FRET样品的荧光衰减曲线，对比分析寿命差异。该方法抗干扰能力强，适合对检测精度要求较高的实验，但对设备要求高，专用附件成本高昂，数据采集时间较长[5]。
实验流程
整个过程大致可以分为载体构建、细胞转染与样本处理、荧光信号检测、数据采集与分析几个关键阶段，接下来将以CFP-RFP受体光漂白法为例来介绍关键步骤。
融合蛋白表达载体的构建：构建4种重组表达载体，分别为CFP-蛋白A融合载体（供体）、YFP-蛋白B融合载体（受体）、仅含CFP或YFP基因的载体（阴性对照）、CFP-YFP融合载体（阳性对照）。荧光蛋白的融合设计通常优先选择融合在远离已知功能结构域的一端，并采用柔性连接肽来保障蛋白正确折叠。
细胞转染与样本处理：常规实验设置需设置五组，分别为实验组（导入CFP-蛋白A融合载体 + YFP-蛋白B融合载体）、阴性对照1组（单独转染CFP-蛋白A融合载体）；阴性对照2组（单独转染YFP-蛋白B融合载体）；空白对照组（转染空白对照载体）；阳性对照组（转染CFP-YFP融合载体）。对于光漂白法，可在正式试验中仅使用空白对照和实验组。将培养至对数生长期的细胞接种于无菌载玻片或玻底培养皿中，培养至50%至70%汇合度时进行转染，培养24 - 48 h用预温至37℃的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2-3次。洗涤完成后，可进行活细胞成像，在载玻片上滴加10 μL抗淬灭剂盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余液体，制片后立即置于暗盒中避光保存，等待信号检测。
荧光信号检测：使用单供体和单受体样品分别标定各检测通道的激发光功率、记录供体渗漏至FRET通道的比例系数，阳性对照样品确认系统检测到预期的最大FRET信号。制片后的样本置于激光共聚焦荧光显微镜的37℃恒温载物台上，保持激发光强度、曝光时间一致，分别切换至三个预设通道，对每组样本进行信号采集。供体通道（Fd）为CFP激发、并在CFP激发光通道下采集（470-500 nm）；FRET通道（Fret）为CFP激发、并在YFP发射光通道下采集（525-560 nm）；受体通道（Fr）为YFP激发下，采集YFP发射光通道下采集。对于光漂白法，选择一个表达水平适中的双阳性细胞区域，采集供体通道图像（Fd1）；随后高强度、长时间连续激发受体直至受体荧光信号下降至初始的20%以下；再次在相同供体激发条件下采集供体荧光图像（Fd2）。
数据采集与分析：将空白对照组三个通道的信号强度作为背景值，分别从实验组、阴性对照1组、阴性对照2组对应的通道信号中减去，得到扣除背景后的真实信号值。常规FRET效率经典计算公式为FRET效率（E）=1 - Fd/Fd0。其中Fd为实验组CFP通道扣除背景后的荧光强度，Fd0为阴性对照1组CFP通道扣除背景后的荧光强度。对于光漂白法，E= (Fd2 - Fd1)/Fd2×100%。
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参考文献：
1. Shrestha D, Jenei A, Nagy P, Vereb G, Szöllősi J. Understanding FRET as a Research Tool for Cellular Studies. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(4):6718-6756.
2. Hunke S, Müller VS. Approaches to Analyze Protein-Protein Interactions of Membrane Proteins. In: Protein Interactions. IntechOpen; 2012.
3. Gohil K, Wu SY, Takahashi-Yamashiro K, Shen Y, Campbell RE. Biosensor Optimization Using a Förster Resonance Energy Transfer Pair Based on mScarlet Red Fluorescent Protein and an mScarlet-Derived Green Fluorescent Protein. ACS Sens. 2023;8(2):587-597.
4. Frommer WB, Davidson MW, Campbell RE. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 2009;38(10):2833-2841.
5. Algar WR, Hildebrandt N, Vogel SS, Medintz IL. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 2019;16(9):815-829.
